门冬酰胺酶的制备与分析

2021年1月21日发(作者：蒋齐生)

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱


黄妤璠


龙益如


王敏敏


白华山

1
原理

本实验主要是利用基因工程手段构建< br>L-
天冬酰胺酶基因工程菌。
L-
天冬酰
胺酶的生理作用主要体现于其 抗癌抗肿瘤活性，
特别是对非霍奇金淋巴瘤和
ALL
的有很强的抑制作用，
目 前适用于治疗黑色素瘤、
非何杰金病淋巴瘤等，
也可以
用于治疗急性单核细胞性白血病 、慢性淋巴细胞性白血病等。

目前，
我国虽已投入生产
L-
天冬酰 胺酶，
但是较国外生产成本高、
菌种产酶
活性低，
提取纯化工艺落后。
针对这些问题，
本实验对大肠杆菌重组
L-
天冬酰胺
酶的制备、纯化与鉴定 进行了系统性的探究，意图改进重组
L-
天冬酰胺酶的表
达，优化其纯化工艺，分析其 鉴定方法与性质。

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、
表达与鉴定的摸 索；
酶蛋
白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、
硫酸铵分级沉淀、
CM-Sephadex
和
DEAE-Sepharose
离子交换层析以及亲和层析；
重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。

2
实验材料

实验仪器见表
1.1
。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。

表
1.1
实验仪器或装置

仪器名称

超净工作台

PCR
扩增仪

恒温培养箱

超低温冰箱

型号





生产厂家






台式离心机

恒温摇床

涡轮振荡器

高压灭菌锅

蛋白电泳仪

核酸电泳仪

凝胶成像仪

紫外分光光度计

高效液相色谱仪

扫描型紫外分光光度
计

制冰机

超声清洗机



























实验试剂和材料见表
1.2
。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现
有条件核定。

表
1.2
试剂和材料

试剂或材料


野生型菌株

pMD18-T
pET-22b
Nde
Ⅰ

Xho
Ⅰ

T4 DNA Ligase
DNA
纯化试剂盒

Ni-NTA
树脂纯化试剂盒

质粒提取试剂盒

胶回收试剂盒

CaCl
2

材质或规格

CPU21009
50ng/
μ
l
50ng/
μ
l
10U/
μ
l
10U/
μ
l
350U/
μ
l
离心柱型

离心柱型

离心柱型

离心柱型

60mmol/L
来源

实验室储存

宝生物工程有限公司

宝生物工程有限公司

宝生物工程有限公司

宝生物工程有限公司

宝生物工程有限公司

天根生化科技（北京）有限公司

天根生化科技（北京）有限公司

天根生化科技（北京）有限公司

天根生化科技（北京）有限公司

实验室储存


PBS
NaCl
Taq
酶
Mix
(NH
4
)
2
S
2
O
8

C
2
H
6
OS
CH
4
O
冰乙酸

C
2
H
6
O
氨基丁三醇

考马斯亮蓝

SDS
Nessler's
试剂

酵母粉

L-
天冬酰胺

蛋白胨

甘氨酸

琼脂糖

葡萄糖

TEMED
溴酚蓝

IPTG
丙三醇

50x
分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

Reagent,ACS
分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

分析纯

食品级

优级纯

分析纯

优级纯

分析纯

实验室储存











美国
Spectrum
公司


英国
OXOID
公司










3
实验思路与步骤

本实验设 计从大肠杆菌野生型菌株
CPU210009
中提取总
DNA
，通过
PCR
扩增目的基因
ansB
，随后对
PCR
产物进行纯化。后分别 构建重组克隆载体和表
达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将< br>
构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用
IPTG
诱导表达重组蛋白 ，对
重组蛋白进行提取纯化。
再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，
SDS-PAGE电泳测定
分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。
同时，
实验过程 中以纳
氏试剂法监控
L
-
天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。

3.1

大肠杆菌
L-
天冬酰胺酶
II
基因
ansB
的获取

3.1.1
大肠杆菌
ansB
基因的选择与引物

从
NCBI
中查找获取大肠杆菌
ansB
的基因序列，其
Gene ID

为< br>947454
，
基因长度为
1047bp,
序列如下：

1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca







61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac






121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg






181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc






241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat






301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc






361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc






421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat






481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt






541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct






601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc






661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat






721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc







781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg






841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc






901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac






961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag





1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa
根据该基因序列，使用
Primer 5.0
设计引物，并考虑到后续构建克隆载体 和表
达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如
下：

上游引物

P1
：
GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA
下游引物

P2
：
GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG
上游引物
P1
中包含一个
Nde Ⅰ
酶切位点，
下游引物中包含一个
Xho Ⅰ
酶切位点。
所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。

3.1.2
大肠杆菌全基因组
DNA
的提取

使用大肠杆 菌基因组
DNA
全提取试剂盒提取

全基因组
DNA
，具体步
骤如下：

(1)
从实验室斜面保存的


野生型菌 株
CPU21009
上，
取接种环，
挑单菌落，
转移到
50 mL
的液体
LB
培养基，在温度
37Ⅰ
、

180 r
／
min
发酵过夜。

(2)
取菌液
1
mL
至
1.5
mL
的离心管管中，离心机参数调至
12000
离心
2
min
，
离心
3 min
，弃去上清液。

(3)
加入
0.2
mL
GA
缓冲液，用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮。加入
4
μL
RN aseA(100mg
／
mL)
溶液，用涡旋振荡器振荡振荡
15 s
，室温放置
5 min
。


(4)
加入
0.02 mL
蛋白酶
K
，混合均匀。

(5)
加入
0.02
mL
GB
缓冲液，混合均匀，将水浴锅调到
70Ⅰ
，把离心管放入
10
min
，短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠。

(6)
加入
0
．
22
mL
分析纯乙醇，在
15
s
内充分混匀，此时会出现絮状物，短暂
离心除去
EP
管盖和管壁的水珠。

(7)
将
(6 )
中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中，
离心机参数调至
12000< br>离心
1 min
，弃去柱底液体，安装好吸附柱。

(8)
加
0.5

mL GD
缓冲液至吸附柱中，离心机参数调至
12000
离心
1 min
，倒掉
柱底液体，并安装好吸附柱。

(9)
加
0.6

mL PW
漂洗液至吸附柱中，离心机参数调至
12000
离心
1 min
，倒掉
柱底液体，并安装好吸附柱。

(10)
再加
0.5 mL GD
缓冲液，离心机参数调至
12000
离心
1 min
倒掉柱底液体。

(11)
将吸附柱放入收集管中，
离心机参 数调至
12000
离心
2 min
，
倒掉柱底液体。
在室温下静置
20 min
吸附柱，完全晾干漂洗液，使吸附材料干燥。

(12)
将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，
悬滴
0.04 mL
双蒸水到吸附膜
的中间部分，
在室温静置
5 min
，
离心机参数调至
12000
离心
2 min
，
收集溶液。

(13)
将
(12)
中收集 的溶液吸净后加回吸附柱，
放置
5 min
，
离心机参数调至
12000
离心
2 min
。

(14)
将提取后的
DNA
进行琼脂糖凝胶电泳 鉴定，以便用于后续操作。

3.1.3
PCR
扩增
ansB
基因

(1)
在
PCR
扩增仪上设计如下反应程序：


①模板
DNA
预变性
94Ⅰ 5 min
；

②变性：
94 Ⅰ
条件下
45 s
；

③退火：
58 Ⅰ
条件下
30 s
；

④延伸：
72 Ⅰ
条件下
1 min
；

⑤循环步骤②～④
30
次；

⑥最后在
72 Ⅰ
延伸
10 min
。

(2)
在
PCR
管建立整体为
0.05 mL
的
PCR
扩增反应体系：

大肠杆菌总
DNA
模板

0.003 mL

上游引物
P1
























0.001 mL

下游引物
P2
























0.001 mL

Taq
酶
Mix














0.025 mL

0.02 mL

ddH
2
O


























(3)
将样品混合后稍作离心，将反应管放入
PCR
扩增仪中进行
PCR
反应。

(4)
结束
PCR
扩增，
取
0.005 mL
溶液，
进行
1
％
Agarose gel electroph oresis
鉴定，
判断是否有基因片段存在于
PCR
中，以及其大小。
3.1.4
PCR
扩增产物的纯化

(1)
将
0.04 mL PCR
扩增后体系用双蒸水调整至
0.1 mL
，
加入
0.5 mL
结合液
DB
，
充分混匀。

(2)
将
(1)
中得到的溶液加入安装好的吸附柱，在室温下静置
1 min
，离心机参数
调至
12000
离心
1 min
，倒掉管底的液体。

(3)
加入
0.5 mL
用于洗涤的溶液，离心机参数调至
12000
离心
1 min
，倒掉管底

的液体。

(4)
加入
0.5 mL
用于洗涤的溶液，离心机参数调至
12000
离心
1 min
，倒掉管底
的液体。

(5)
将吸附柱重新安装好，空管离心
2 min
，尽最大可能得除去用于漂 洗的液体，
防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响。

(6)
取吸附柱，悬滴
0.04 mL
双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置
5 min
，离
心机参数调至
12000
离心
2 min
，收集溶液。

(7)
将离心管中的双蒸水，重新加入吸附柱中，室温放置
2
min
后，离心机参数
调至
12000
离心
2 min
。

(8)
将
PCR
纯化产物进行
1
％

Agarose gel electrophoresis
鉴定，
以用于后续操作。

3.2
重组克隆载体的构建

为了大量准确扩增目的基因片段，采用构建克隆载体的方法。由 于
PCR
扩
增时采用的
DNA
聚合酶为
Taq
酶，
故扩增序列带有一段
“A”
，
采用
TA
克隆连接
载 体。载体选择
T
载体，且要求载体在宿主细胞内为高拷贝，能够稳定自主表
达。这里选 用
pMD 18-T
载体。构建好的克隆载体导入宿主中后，要进行阳性克
隆筛选与鉴 定，并用双酶切回收。

3.2.1
目的基因与载体的连接

pMD18-T Vector
是一种高效克隆
PCR
产物
（
TA Cloning< br>）
的专用载体。
本载
体由
pUC18
载体改建而成，
在
pUC18
载体的多克隆位点处的
Xba I
和
Sal I
识别
位点之间插入了
EcoR V
识别位点，用
EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的
3
＇
端添加
“T”
而成。因大部分 耐热性
DNA
聚合酶进行
PCR
反应时都有在
PCR
产

物的
3
＇末端添加一个
“A”
的特性，所以可 以大大提高
PCR
产物的连接、克隆效
率。载体酶切图谱如图
1.1
。

本载体以
pUC18
载体为基础构建而成，
所以它具有同
pUC18
载体相同的功
能。此外，高效连接液
Solution
I可以在短时间内（约
30
分钟）完成连接反应，
其连接液可以直接用于细菌转化， 大大方便了实验操作。实验操作如下：

(1)
在一个标准的
10μL
连接反应体系中加入：

pMD18-T
载体



1μL

PCR
纯化产物

1.5μL

ddH
2
O


2.5μL

Solution I





5μL

(2)
16
℃连接
2 h
。


图

1.1
克隆载体
pMD 18-T
的酶切图谱

3.2.2
大肠杆菌
Top 10
感受态细胞的制备

大肠杆菌
TOP 10
菌株来源于
MC1061
菌株，是目前实验室最常用的基因工
程宿主细胞 之一，基因型与
DH10B
高度类似（
DH10B
为
galE15< br>型，而
TOP10
为
galU
型）
，具有链霉素抗性。其适用 于高效的
DNA
克隆和质粒扩增，能保证
高拷贝质粒的稳定遗传。





(1)
从实验室保存的大肠杆菌
Topl0
菌株斜面上，用接种环挑取单个菌落，转移
至液体的
50 mL LB
培养基中，
37 Ⅰ
下
180 r/min
摇床过夜发酵。

(2)
取
0.01 mL
菌液转移到液体的
50 mL LB
培养基中，
37
℃下
150 r/min
振荡约

3.5 h
左右，至菌液对数期。

(3)
将液体培养基全部移入
50 mL
离心管中并配平，
4 Ⅰ
下离心机参数调至
3000
离心
10 min
，弃去上清液。

(4)
添加
15 mL
预冷的氯化 钙溶液轻轻吹打。
4Ⅰ
下离心机参数调至
3000
离心
10
min
，弃去上清液。

(5)
添加
1.5 mL
预先冰浴的氯化钙
(60 mmol/L CaCl
2
、质量分数为
15
％的甘油、
pH 7.2
)< br>溶液，用枪轻轻吹至完全悬浮，分装至干净的
EP
管，每管
0.2 mL
，放在
80Ⅰ
超低温冰箱。

3.2.3
重组克隆质粒的转化

(1)
含有
Ampicillin l00 mg/mL
的
LB
培养基的制备。

(2)
取一管
200μL
的大肠杆菌
Top l0
感受态细 胞，在冰上化冻，加入重组质粒的
连接产物
10μL
，轻轻用枪吹打混匀。

(3)
另做一个宿主菌阴性对照，
即
200μL
的感受态细胞，加
10μL
无菌水，
混匀。

(4)
冰浴
30 min
。

(5)
迅速放入在
42Ⅰ
下热击
90 s
，再迅速放回冰中冰浴
3 min
。

(6)
加入到
1 mL
的液体
LB
培养基混合，
37Ⅰ 150 r/min
培养
1 h
，细胞恢复正常
生长，并表达
Ampicillin
抗性基因。

(7)
将上述菌液摇匀后，分别取
0.1 mL
、
0.2 mL
、
0.4 mL
在含有
Ampicillin
的
LB< br>培养基板上均匀涂布。

(8)
将上述平板
37Ⅰ
倒置培养过 夜
(
不超过
24 h
)
，观察菌斑的出现效果。

3.2.4
阳性克隆的筛选与鉴定


(1)
从
Ampicillin LB
培养基板上挑取单个的菌落，
液体
Ampicillin
、
LB
培养基中
振荡过夜，
取< br>5 mL
过夜菌液加入离心管中，
离心机参数调至
12000
离心
1 min
，
弃去上清废液。

(2)
使用离心柱型质粒提取试剂盒。向菌体沉淀管中加入
0.5 mL Pl
溶液
(
含溶菌
酶、核糖核菅酸酶
)
，用移液设备彻底悬浮细菌细胞 沉淀。

(3)
向离心管中加入
0.6 mL P2
溶液，翻转6-8
次，充分裂解菌体。在这一点上。
菌液变得澄清、黏黏的，时间不超过
5 min
，以免损坏质粒。如果不澄清，可能
是由于过量加菌液，未能彻底裂解，应减少细菌生长 量。

(4)
向离心管中加入
0.6 mL P3
溶液，马上轻轻地 翻转
6-8
次，混合彻底，会有白
色絮状物出现。离心机参数调至
12000
离心
10
min
后，离心管底有固体出现。
加入
P3，
立即翻转，
避免局部沉淀。
若上清液有微小白色固体，
再离心取上清。

(5)
将上清液加进平衡过的吸附柱中，吸附柱安装好，离心机参数调至
1 2000
离
心
2 min
，小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱，安装好吸附柱。

(6)
加入
0.6 mL PW
漂洗液，将台式离心机参数设置为
12000
，离心
1 min
，倒掉
管底废液，安装好吸附柱。

(7)
加入
0.6 mL PW
漂洗液，将台式离心机参数设置为
12000
，离心
1 min
，倒掉
管底废液，安装好吸附柱。

(8)
将台式离心机参数设置为
12000
，将组件离心
2 min
，除去吸附柱中的残留的
用于漂洗的液体。吸附柱在室温下静置
5 min
，防止用于漂洗的液体中残留的分
析纯乙醇在下游反应中有影响。

(9)
将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴
0.04
mL
双蒸水到吸附膜

的中间部分，
在室温静置
5 min
，
离心机参数调至
12000
离心
2 min
，
收集溶液。

(10)
将
(9)
中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置
5
min
，离心机参数调至
12000
离心
2 min
。

(11)
取
5 μL
质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳。

(12)
克隆载体中含有
Nde
I
和
Xho
I
两种限制性酶酶切位点，构建
10μL
双酶切
反应体系：

Nde I

Xho I

10 × H buffer


pMDl8-T-ansB
质粒


0.5μL

0.5μL

1μL


8μL

37
℃酶切
2 h
后，取
5μL
进行
1
％琼脂糖凝胶电泳。

3.3
重组表达质粒的构建

3.3.1
重组克隆载体质粒的提取

(1)
从相应的培养基上挑取含有重组克隆载体< br>pMDl8-T-ansB
质粒

的菌种的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体
LB
培养基，用
180
r/min
的参
数，在
37
Ⅰ
下培养
12
h
以上。在离心管中加
5
mL
收获的菌液，离心机参数调
至
12000
离心
l mi n
，
留下沉淀。
pMDl8-T-ansB
质粒提取过程同
1.3. 2.4
的
(2)-(11)
。

(2)5μL
质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳，其余
-20Ⅰ
保存。

3.3.2
重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应

(1)Nde I
、
Xho I
双酶切重组克隆载体
pMDl 8-T-ansB
质粒反应体系：

pMDl8-T-ansB
质粒

40
μL


10×

H buffer

Xho I

Nde I

总体积

5
μL

2.5
μL

2.5
μL

50
μL

(2)pET-22b Plasmid
酶切反应体系：

pET-22b Plasmid

10× H buffer


Xho I


Nde I

总体积


40 μL

5 μL

2.5μL

2.5μL

50 μL

(3)
分别将两个体系置于
37Ⅰ
水浴中酶切
2 h
后，
取
5μL
此进行
1
％琼脂糖凝胶电
泳。

3.3.3
酶切片段的胶回收

(1)
经琼脂糖凝胶电泳确认 酶切结果后，剩下的
45μL
酶切反应产物中均匀加入
5
μL l0
×上样缓冲液，再全加到大孔胶的上样泳道中。

(2)
在
100 V
电压下电泳至条带跑至总胶长的
2/3
处。将胶块放入
EB
浓度为
0.5μg/mL
的溶液中染色，大小为
1000 bp(ansB)
、
5000 bp(pET-22b)
左右。

(3)
在紫外灯照射下，
判定
DNA
位置，
用干净的刀子分 别切下的含有要回收
DNA
的胶块。

(4)
取
1.5 mL EP
管，放到分析天平上称重后，加入切下的胶块再称重，计算胶块
的质量。