PCR假阳性问题

2021年1月21日发(作者：茹麓泉)
假阳性
：

（一）假阳性现象

假阳性是指检测阴性材料得 到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个
或几个阳性结果
，提示本次实验中其它 标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对
照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因

1.
样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本 的容器被污染，或样本放置时，由于密
封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样 本核酸模板在提取过程
中，由于吸样枪污染导致标本间污染；

2.
PCR
试剂的污染：主要是由于在
PCR
试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸
水及其它溶液被
PCR
核酸模板污染。

3. PCR
扩增产物污染 ：这是
PCR
反应中最主要最常见的污染问题。因为
PCR
产物拷
贝 量大
(
一般为
1013
拷贝
/ml)
，远远高于
P CR
检测数个拷贝的极限，所以极微量的
PCR
产
物污染，就可形成假阳性。

4.
气溶胶污染：在空气与液体面摩

擦时就可形成气溶胶，在 操作时比较剧烈地摇动
反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算 一个气溶
胶颗粒可含
48000
拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题 。

5.
实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在 纯化过
程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具
有很强的生命力
，其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照< br>的检验室，这个问题比较常见。

（三）假阳性问题的试验控制

在每 次
PCR
检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴
性时 ，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明
DNA
提
取（
RNA
提取、
RNA
反转录）、
DNA
扩增和电泳鉴定 工作体系正常。在阴性对照样品和
阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有 设立试验全程的对
照，才能证明试验结果成立。

造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：

1
、DNA
阳性对照：以含有目的片段的
DNA(
或质粒）作为模板进行扩增，证明< br>PCR
试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
（注意：阳性 样品扩增
效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。

2
、
DNA
阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增
过程中无假阳 性现象。

3
、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4
、
PCR
抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样 品
DNA
，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品
DNA
中存在
P CR
抑制物。

5
、空白提取对照
：空白提取对照扩增结果为阳性，
说明
DNA
提取试剂可能受到污染。