三代试管婴儿流程-只有两条精子能做试管
总流程
全长质粒
菌液摇菌保
种提质粒
加引物
PC R
连接载体
跑胶
回收
酶切保护
碱基
摇菌
提质粒感受态菌
液制备
跑胶
转化感受
态菌液
涂板
挑斑
液培固培
配制
酶切
跑胶
测序
取质粒大肠杆菌菌液、摇菌、保种
1.
细菌
-80°< br>C
冻存液于室温快速融化后放于冰上。从
-20°
C
取出相应的抗生素
FOXJ2-
卡那
-Kana
，
AUF1-
氨苄
- Amp
。
2.
在超净工作台，左手取试管架上的
LB< br>液培试管过火，右手拿
10ul
的枪，其小指
和无名指背夹软胶塞，取下软胶塞 ，软胶塞和管口都需要过火灭菌。
3.
倾斜
LR
试管， 枪接上无菌白枪头，先加抗生素
4ul
，再加细菌
4ul
，注意更换枪
头，可以将液体打在试管壁上，倾斜试管去够液体。
4.
LB
液培：抗生素：细菌
=4ml
：
4ul
：
4ul
即（
1000:1:1
）
5.
软胶塞和试管口 都过火后塞上，过火，放于
37°
C
摇床
250rpm14-16h
，浑浊。
挑斑
1.
打开
LB
液培管 ，
软胶塞和试管口均需过火灭菌，
倾斜用无菌枪头加入合适抗生素。
2.
用无菌白枪头挑取
LB
固培板上单个大菌落，入
LB
液培管中，注意不要挑到双菌
落，放入液培管中不要碰到管壁。
3.
37°
C
摇床快摇转速
250rpm
，14-16h
，出现浑浊。
保种
：每个灭菌的
1.5mlEP
管中先用细滴管加入约
6
滴
灭菌甘油
（
4:1
）< br>200ul
，
再加入菌液
800ul
，混匀，
-80°
C
保存。
提质粒
1.
将液培试管中的菌种至
2ml EP
管中
10000rpm
离心
1min
，收集细菌弃上清，
重复操作，最后
EP
管倒置用纸巾将管中剩余上清吸干。
2.
加入
250ul
的
Solution I
（保存在冰箱中）
，用
100ul
的枪吹打混匀至重悬。
3.
加入
250ul
的
Solution II
（用于裂解，注意配制的日期）
，慢摇颠倒
6
次左右混
匀，呈澄清，静置1-2min
。
4.
加入
350ul
的
Solution III
充分混匀，反复颠倒
6
次，出现绒毛白色絮状物。
5.
离心
12000rpm*10min
，准备其他东西，
60°
C
预热灭菌
ddH2O
。
6.
将新的蓝色吸附柱放入
2ml
的
无盖
EP
管
中，小心完 全将上清吸至蓝色吸附柱，
并做好标记，贴壁加入，
10000rpm
离心
1min
。注意不能正柱子中心加，也不
要一次放入太满的上清，防止破坏滤膜。再重复以上操 作，将离心后滤下的收集管
中的液体再吸入蓝色柱子，再次离心，弃去裂解液。
7.
在蓝色柱子里加入
700ul
的
DNA wash buffer
，离心
10000rpm*1min
，弃
去收集管中液体，再在 蓝色吸附柱中加入等量
DNA
wash
buffer
，再离心
1 0000rpm*1min
，弃去收集管中液体，可以换新的
1.5ml EP
管。
8.
在
60°
C
恒温离心机 中，将蓝色吸附柱盖子打开，空转
3-5min
，烘干。
9.
再更换一个新的
1.5ml EP
收集管，
做好标记
。
10.
向蓝色吸附柱中央垂直靠近滴落
30ul
灭菌
ddH2O
，
放入
60°
C
烘箱烘干
5min
左右。
11.
离心
13000rpm *2min
，
可重复一次，
将收集管中的液体再次加入蓝色吸附柱中，
以便充 分将膜上的物质溶入水中。
12.
去除蓝色吸附柱。测浓度（
nucleic acids
）后
-20°
C
保存。
酶切
1.
采用
20ul
体系：
冰上操 作——酶拿出后立即置于冰上，且最后加入
2.
10*FD Green Buffer
2ul
3.
全长质粒
DNA
或者胶回收的全长
DNA
或酶切后地空载
DNA
1000/
核酸浓度
4.
PCR
跑胶回收的片段
DNA
或者片段酶切后跑胶后的片段
200/
核酸浓度
（因为
DNA
核酸浓度是
ng/ul
，
取得
1ug
的核酸就相当于
1000/
核酸浓度得到
1ug
核酸所需要多少
ul
）
5.
FOXJ2
酶
1
：
Xhol 1ul
酶
2
：
BamH1
1ul
6.
AUF1
酶
1
：
Ecro1
1ul
酶
2
：
BamH1
1ul
酶在三号冰箱下层
—
20°
C
保存，自取。
7.
灭菌
ddH2O
：
约
15ul
，< br>配平到
20ul
！
反复枪吸混合，
不可震荡！
包装好放
37°
C
水浴
3
小时。
8.
空载也 需要酶切，并且设置空载的对照，就是说空载设为
2
个，一个是和
DNA
片< br>段一样酶切的，
一个是没有酶切的直接跑胶。
Foxj2
空载是
EGFP
，
AUF1
空载
是
FLAG
。
空载酶
切的酶与所选分子
酶切的酶一样
。
9.
下一步再次跑胶以验证目的条带切除成功，并加以提纯。
10.
跑胶后的核算及时测浓度使用，不要保存太久，
-20°
C
保存，很短时间
4 °
C
也可
以，核酸浓度峰和蛋白峰类似，也至少在
100
以上，可以 多
PCR
，以方便后续操
作，如浓度太低，浓度峰也会有变化。
PCR
1.
消毒
0.2ml
的
EP
管 ，黄、白枪头。高压蒸汽灭菌，再烘烤。
（也可以不消毒。
）
2.
按购置的引物
EP
管上的标签所示假如所需的
ddH2O
，
从而配置合适浓度的引物。
3.
将上引物和下引物各吸取
5ul
加入到一个新的
0.2mlEP
管中，
再加入
90ul
灭菌
ddH2O
，配置为
100ul
引物混合物。
4.
在冰上
将以下成分按照从量多到少的原则加入至无菌已标记好的
0.2mlEP
管中。
5.
每个
0.2ml EP
管中分别依次加入
2*Taq Master Mix25ul
、
22u l
灭菌
ddH2O
、
2ul
引物混合物、
1ul
模 板质粒
。
6.
将上述混合物充分混匀后离心
15
秒使反应成分集于管底，后立即置于
PCR
仪上
进行扩增。
（最好
当日
跑胶，
48h
后条带不可用。
）
步骤
step
TempL
TempH
Time
Goto
Cycle
+Temp/c
+Time/c
Ramp
预变性
1
94
94
5:00
0
0
0
0
#.#
变性
2
94
94
0:30
0
0
0
0
#.#
退火
3
TM
高值
-
5
延伸
4
72
72
1:00
2
35
0
0
#.#
延伸
5
72
72
10:00
0
0
0
0
#.#
保存
6
4
4
59:00
6
50
0
0
#.#
TM
高值
0:30
0
0
0
0
#.#
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