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实验四
免疫学实验
一、机体体液免疫功能测定
（一）凝集反应
【目的】
了解玻片凝集试验、
试管凝集试验及胶乳间接凝集抑制试验的操作过程、
结
果 分析和实际应用。
【
原理
】
颗粒性抗原
(细菌、
细胞等
)
与相应抗体在一定电解质存在的条件下发生特异
性结合并 出现肉眼可见的凝集块的现象称为凝集反应。
凝集反应既可用已知抗体
检查和鉴定未知的抗原< br>(
如鉴定细菌
)
，也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；
既可用作定 性检测，又可用于定量检测。
凝集反应分两种。
一种是颗粒性抗原与抗体直接结合出 现的凝集现象，
称为
直接凝集反应；另一种是将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的载休颗粒表 面，
再与相应的抗体结合而出现的凝集反应，
称为间接凝集反应。
如将抗体吸附于载< br>体颗粒表面，再与相应的抗原结合而出现的凝集反应则称为反向间接凝集反应。
1
、
玻片凝集反应
【材料】
伤寒诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌培养物、载玻片、生理盐水等。
【方法】
①取载玻片
1
张，左侧加生理盐水
1
滴，中间
及右侧各加伤寒诊断血清
1
滴；
左
中
右
②用接种环取伤寒沙门菌培养物少许，分别
与盐水及中间的伤寒诊断血清混匀。同法取大肠
埃希菌培养物与右侧伤寒诊断血清混匀；
③轻轻摇动玻片
1
～
2min
后，观察结果；
生理盐水
伤寒诊断血清
伤寒诊断血
④观察后，将玻片直接投入消毒缸，不要冲
＋
＋
＋
伤寒沙门菌
伤寒沙门菌
大肠埃希
洗，以防污染。
【结果
】
出现凝集物者为阳性反应，均匀混浊无凝集物
者为阴性反应。
【注意事项】
玻片凝集反应
①用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，
不可有 杂菌污染以及前一试剂残
留。
②用接种环取细菌时应先烧灼灭菌，待冷却后方可挑取细菌。
③用接种环加细菌于血清中后，
应先烧灼接种环，
再取细菌加入另一血清中。
【结果分析】
左：
中：
右：
应用：
2
、
试管凝集反应
试管凝集反应为半定量试验，常用已知抗原检测患者血清中相应抗体的效
价。
【材料】
伤寒诊断血清
(
抗体
)
、
伤寒 菌液
(
抗原
)
、
生理盐水
(NS)
、
刻度 吸管、
试管等。
【方法及结果】
见表
试管凝集反应的方法
试
管
1
2
3
4
5
6
7
生
理
盐
水
(ml)
0.9
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
弃
去
0.5
0.5
伤
寒
诊
断
血
清
(ml)
0.1
0.5
0.5
0.5
0.5
..
0.5
＋
NS 0.5
血
清
稀
释
倍
数
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
对
照
菌
液
(ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
血
清
最
终
稀
释
倍
数
.
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
对
照
56
℃
4
小时
,4
℃冰箱过夜
,
次日观察结果
结
果
效
价
【结果判断】见
表
手持试管，对光观察管内液体混浊度及管底沉淀物之性状。
试管凝集反应结果的判读
记录符号
上层液体
管底凝集物
++++
完全澄清
凝块多而明显，全部沉于管底
+++
微混浊
凝块显著，大部分沉于管底
++
稍混浊
凝块较明显，中等沉于管底
+
混浊
凝块不太明显，少许沉于管底
-
混浊
细菌均沉积于管底，呈小园点状，不见
凝块
凝集效价的判定：呈
“
++
”
阳性反应的最高稀释倍数为该血清的效 价
(
也称滴
度
)
。对照管
(
第
7
管
)
应为阴性。
【注意事项】
观察结果时，
先看生理盐水对照管，
可见管底有圆点状细菌沉积，
边缘整齐，
轻摇则分散为混浊的菌 液，似烟雾状。
【思考题】
试管凝集反应的临床应用：
（二）沉淀反应
< br>可溶性抗原
(
如血清、
细菌浸出液、
毒素等
)
和相应 抗体结合，
在适量电解质
存在的条件下，
经一定时间，
二者在比例适当时形成 肉眼可见的沉淀物，
称为沉
淀反应。
参与反应的抗原称为沉淀原，
而相应的抗 体称为沉淀素。
由于沉淀反应
的抗原多系胶体溶液，
沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，
为获得抗原与抗体的适
宜比例，
操作中通常稀释抗原而不稀释抗体，
并以抗原 的稀释度作为沉淀反应的
效价。
本实验介绍琼脂扩散试验和对流免疫电泳。
【目的】
了解单扩、双扩及对流免疫电流的原理、操作步骤及临床应用。
1
、单向琼脂扩散试验：
【原理】
琼脂属于大分子多糖 ，
100
℃时熔化，低于
45
℃时凝固而形成网状结构，并
能允许抗 原抗体的在其中自由扩散。
琼脂扩散试验是指可溶性抗原与相应抗体在
琼脂内扩散，若二者对应 且比例合适，则出现白色沉淀物。
单向琼脂扩散试验系定量试验，
通常以已知抗体测 定未知抗原。
试验中将定
量的抗体混合于琼脂内倾注于玻片上制成琼脂板，
凝固后打孔 。
再将待检抗原加
入孔中，
因抗体与琼脂混合凝固后，
不会再扩散，
只有孔中抗原向四周扩散，
抗
原、
抗体在比例适合处可形成白色沉淀环。
由于 只有抗原扩散故称之为单向扩散。
沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原 与固定浓度的抗血
清反应后测得沉淀环的直径作纵座标，
以抗原浓度为横座标，
绘制标 准曲线。
测
量待检抗原的沉淀环直径，
从标准曲线中求得其含量。
本试验主要 用于检测标本
中各种免疫球蛋白或血清补体含量。
目前也常采用血清全自动分析仪检测各种免< br>疫球蛋白或血清补体含量。
【材料】
①人免疫球蛋白
Ig G
的诊断血清
(
冻干羊抗人
IgG
即抗体
)
。
②人免疫球蛋白标准血清（抗原），待检人血清（抗原）。
③打孔器、加样器、
37
℃恒温箱、
1.8
％琼脂玻片等。
【方法】
①制板：按抗血清效价的一半，用
56
℃预热的生理盐水 稀释抗血清，再加
入等量的冷却至
56
℃的琼脂轻轻混匀，灌板
(3ml/< br>板
)
。
②打孔：以打孔器打孔，孔径
3mm
，孔距
1cm
，每板
2
排，每排
5
个孔，用
针头把孔内琼 脂块挑出。
③按说明书要求稀释标准血清与待检血清。
待检血清
1
：
50
稀释，
标准血清
系列稀释至：
1:12.5
，
1:25
，
1:50
，
1:100
，
1:200
。
④加样：用微量加样器在第
1
排孔中依次加入不同稀释度的人标准血清各
10
μ
l
，第二排相邻两孔中加待检血清各
10
μ
l
。
⑤将琼脂板放入湿盒，
37
℃
24h
后测各沉淀环直径。
单扩标准孔示意图
单扩标准曲线示意图
⑥以沉淀环直径为纵座标，
相应孔的
IgG
含量为横座标，
在半对数纸上制作
标准曲线。根据
待检血清沉淀环直径查标准曲线，将查得的
IgG
含量乘以标本
的稀释倍数即为待检血清中的
IgG
含量。
【注意事项】
①灌板时，一 定要将抗血清
56
℃预温
(
但不要超过
56
℃，否则会破坏 抗血
清
)
，再与冷却至
56
℃的琼脂混匀，迅速灌板
(所灌板应厚薄一致，无气泡
)
。
②加样要准确、均一，打孔时孔距不能小于
1cm
。
【结果观察记录】绘图。
含羊抗人
IgG
琼脂
待检血清
单扩实验结果
【临床应用】
：
2
、双向琼脂扩散试验
【原理】
双向琼脂扩 散试验为定性试验。
将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上
相对应的孔内，
两者相 互扩散，
在比例适宜处形成沉淀线。
如抗原与抗体无关则
无沉淀线出现。
本试 验常用于分析抗原抗体的纯度与相互关系。
临床上曾经用于
检测甲胎蛋白
(AFP)< br>，作为原发性肝癌的辅助诊断。
【材料】
①甲胎蛋白免疫血清。
②脐带血血清，待检血清。
③玻片、琼脂、打孔器、加样器等。
双向琼脂扩散
【方法】
①制板：将已熔化 的
1.8
％盐水琼脂倒在玻片上，
3ml/
板。
②打孔：用打孔器照图
1-8
打孔。
③加样：中央孔加甲胎蛋白免 疫血清，
1
和
4
孔加脐带血血清，其它孔内加
待检血清，每孔均加< br>10
μ
l
（。
④将琼脂板置于湿盒内，
37
℃
24h
后观察结果。
【结果及绘图】
待检标本如出现沉淀线，
且与阳性对照的沉淀线相吻合，< br>则为阳性反应。
如
无沉淀线出现或与阳性对照沉淀线完全交叉则为阴性反应。
双扩沉淀线类型
①表示两种 抗原完全相同；
②表示两种抗原完全不同；
③表示两种抗原部分相
同
【注意事项】
①加样时注意不要划破琼脂，以免影响沉淀线形状。
②反应时间要适宜。
时间过长，
沉淀线可解离致假阴性；时间过短，
则沉淀
线不出现。
③加样时，
抗体、
阳性血清及待检标本应各用一支加样器，以免混淆，
影响
实验结果。
④沉淀线出现的位置及沉淀线是否弯曲均有不同意义，应注意分析。
【结果分析】
：
（三）补体溶血试验
【目的】
了解补体溶血试验的原理、方法和应用。
【原理】
补体是具有酶活性的一组球蛋白，不耐热，
56
℃
30min
即被 破坏。其作用
没有特异性，
能与任何抗原抗体复合物结合，
但不能单独与抗原或抗体结 合。
实
验室常用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源。
当用红细胞免疫动物后，
动物免疫血清中即含有特异性抗体
(
溶血素
)
，
若红
细胞与相应抗体结合而有补体存在时，
则红细胞被溶解，
此为溶血反应。
本反应通常作为补体结合反应的指示系统。
临床上如发生输血错误，
也可出现溶血反应。
【材料】
①溶血素
(
抗体
)
、
2
％绵羊红细胞悬液
(
抗原
)
、补体。
②生理盐水、小试管、吸管、
37
℃水浴箱。
【方法】
①取小试管
5
支，
分别注明管号，
按表
1-4
依次 将各成分加入前
4
支试管中。
溶血反应加样程序
1
（
ml
）
试管号
1
2
3
4
2
％绵羊红细胞
0.5
0.5
0.5 0.5
溶血素
(2
个单位
)
.
0.5 0.5 - -
补体
(2
个实用单位
)
.
0.5 - 0.5 -
生理盐水
.
.
0.5 1.0 1.0 1.5
②混匀试管内容物，
将
4
支试管置
37
℃水浴
15
～
30min
，
观察有无溶血现象，
若红细胞溶解，则由红色的细胞混浊液变为红色透明液体。
③将不溶血试管的第
2
、
3
管低速离心
3
～
5min
，使红细胞沉淀，用 滴管将
上清液与沉淀物分开（第
1
管出现溶血，第
4
管不溶血）。< br>
④将第
2
管上清液用毛细管吸入第
4
管，
将第3
管上清液倒入第
5
管，
然后
再按表加入各物。
⑤混匀后，将上述第
2
、
3
、
4
、
5
号试管置
37
℃水浴
15
～
30min
后，观察结
果。
溶血反应加样程序
2
（
ml
）
试管号
2
3
4
5
内容物
第
2
管沉淀物
第
2
管沉淀物
第
2
管上清液
第
2
管上清
液
2
％绵羊红细胞
- - 0.5 0.5
溶血素
(2
个单位
)
.
- 0.5 - 0.5
补体
(2
个实用单位
)
.
0.5 - 0.5 -
生理盐水
2.5 2.5
- 2.0
结果
溶血
不溶血
不溶血
溶血
【结果】
第
2
、
5
号试管出现溶血，第
3
、
4号试管不出现溶血。
【分析】
试管
1
：
试管
2
：
试管
3
：
试管
4
：
试管
5
：
【思考题】
补体有何生物学功能，本实验揭示其何种功能
?
二、机体细胞免疫功能测定
【目的】
了解
E
玫瑰花结试验、淋转试验的原理、方法、结果观察及意义。
（
一）
E
玫瑰花结试验
(
总
T-
花结形成试验)
【原理】
人外周血
T
淋巴细胞表面具有绵羊红细 胞
(SRBC)
受体，在体外一定条件下，
当
T
细胞与
SR BC
混合时，可形成以
T
细胞为中心，四周环绕
SRBC
的花结。< br>E
花
结的形成是
T
细胞独特的标志。
E
花结形成试验 最常用的是总
E
花结试验和活性
E
花结试验。总
E
花结试验 代表被检标本
T
淋巴细胞的总数和百分率；而活性
E
花结试验反映的是对SRBC
具有高度亲和力的
T
细胞亚群，该亚群
T
细胞与
T
细
胞的体内外功能活性有密切关系，在一定程度上反映机体细胞免疫功能。
【结果观察】
绘图
(E
–玫瑰花结形成细胞
)
。
（二）淋巴细胞转化试验
【原理】
T
淋巴细胞在
PHA
的刺激下可转化为淋巴母细胞，
转化过程中的物质基础是
淋巴细胞核
DNA
的合成，
DNA
特有的组成成分是胸腺嘧啶核苷，人工将胸腺嘧啶
核苷 用同位素
3
H-TdR
标记，通过计数淋巴细胞内的放射性就可推知淋巴细胞的
转化程度。
【结果观察】
⑴用形态学检查转化的淋巴母细胞形态特征：
①母细胞：
体积明显增大，
为成熟淋巴细胞的
3
～
4
倍
(
成 熟的淋巴细胞直径
约
6
～
10
μ
m
)
。核 膜清晰，核染色质疏松呈细网状。核内可见明显的核仁
3
个。
胞浆丰富嗜碱性，有伪足 样突出，胞浆内有时可见小空泡；
②过渡型淋巴母细胞：
核质疏松，
可见核 仁胞浆增多，
嗜碱性强，
体积比小
淋巴细胞大；
③核分裂相细胞 ：核呈有丝分裂
(
核膜消失
)
可见许多成堆或散在的染色体。
⑵结果判定
转化的淋巴细胞
×
100%
淋巴细胞转化率
转化的淋巴细胞
+
未转化的淋巴
＝
细胞
⑶绘图
(
淋巴母细胞
)
。
E-
玫瑰花结形成细胞
淋巴母细胞
【思考题】
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