减肥为啥不让喝粥破伤风梭菌

2021年1月19日发(作者：姚奠中)

实验四






厌氧菌


一

、

破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌



（一）目的要求

1.
掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。

2.
熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方
法。






































3.
解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。

（二）器材和试剂

1
．菌种

破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。

2
．培养基

疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖 、麦芽糖、甘
露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养
基。



3.
试剂

革兰染色液（一 套）
、芽胞染色液（石炭酸复红、
95
％酒精、碱性美蓝）
、焦性没食
子酸、
100g/L
氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏 梭菌抗
血清；
2
０
g
／
L
尿素
L-
色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4.
其他


小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体
石蜡 或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药
勺、钯粒；厌氧袋 、厌氧罐、离心机、水浴锅等。

（三）步骤和方法


































1
．破伤风棱菌

（
1
）形态观察

观察 破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽
胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端 ，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为
周身鞭毛。

（
2
）培养物观察

破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养
2
～
7
天后其生长现象为
培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑 ，有少量气体。生成的甲基硫醇、
H
２
S
等使培养
物变臭。











破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。菌落中心结实，周边疏松似
―
羽毛
状
‖
。菌落周围有
α
溶血环，培养时间延长可变为
β
溶血环。

（
3
）生化反应


将五糖发酵管与 牛乳培养基置水浴锅中加热。热煮沸
10min
，迅速冷却。
以无菌吸管吸取破伤风梭 菌纯培养物，分别滴加。于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，
在液面上加一薄层熔化的石蜡。经37
℃孵育
24
～
48h
，观察结果。结果破伤风梭菌五糖（葡
乳麦甘蔗）均不分解，牛乳培养基无变化。
‖

（
4
）破伤风梭菌芽胞染色法

①原理


芽胞具有厚而致密的壁，
透性低，
不易着色，
芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色< br>而一旦染上后又难以脱色的特点设计的。所以芽胞染色法都基于同一个原则，采用

着色 力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，
而芽胞上的染料仍保留，
经复


染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。

②方法：
a.
用破 伤风梭菌培养物涂片，干燥，火焰固定；
b.
滴加石炭酸复红液于涂片上，用
微火加热 至染料冒蒸汽（切勿煮沸）维持
3
～
5min
，加热过程要随时添加染液，勿 让标本干
涸，
待玻片冷却后，
水洗；
c.
用
95
％ 酒精脱色
30s
～
1min
，
水洗：
④滴加碱性美蓝液复染
30s
～
lmin
，水洗。⑤干燥后，镜检。

③结果：芽胞染呈红色，菌体染呈蓝色。










2.
产气荚膜梭菌

(1)
形态观察


产气荚膜梭菌镜下检查为革兰染色阳性粗大杆菌 ，两端钝圆，散在或短链状
排列；荚膜染色法可见肥厚荚膜；芽胞卵圆形，与菌体等宽，位于菌体中央或 次未端。

(2)
培养物观察

产气荚膜梭菌在疱肉培养基中呈现混 浊生长，肉渣呈粉红色，不被消化，
产气甚多；
在血琼脂平板上多数株有双层溶血环；
高层葡萄糖琼脂培养管中，
可见气体产生，
使琼脂有断裂分层现象。

(3)
生化反应

①五糖发酵试验：将五糖发酵管置水浴中加热煮沸
10rnin
，迅速冷却。以无菌吸管吸取产气
荚膜梭菌纯培养物，
分别滴加于五糖发 酵管中，接种后，
在液面上加一薄层熔化的石蜡。经
35
℃孵育
24
～
48h
，观察结果。结果葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖均分解，产酸产气。

1

汹涌发酵现象

a.
原理：产气荚膜梭菌能迅速分解乳 糖产酸，使酪蛋白凝固，并产生大量气体，将凝固的酪
蛋白冲散形成分散的海绵状碎块，
并将培 养基表面的石蜡冲至试管塞处。
此为汹涌发酵现象。


















b.
方法：甩无菌吸管（或接种环）取产气荚膜梭 菌疱肉培养物接种于溴甲酚紫牛乳培养基，
置
35
℃孵育
18
～24h
，观察结果。

c.
结果和意义：一般于孵育
6h
后即可发生，产气荚膜梭菌迅速分解乳糖，产酸产气，酪蛋白
被酸凝固，
形成凝块与乳清，凝 块被产生的大量气体冲击，形成分散的海绵状碎块，将部分
培养基冲至试管口塞处。这种气势凶猛现象， 为本菌的重要特征之一。

③卵磷脂酶试验和奈格尔试验

a.
原理 ：产气荚膜梭菌能产生卵磷脂酶，在卵黄琼脂平板上，能将培养基中可溶性的磷脂酞
胆碱分解生成磷酸胆 碱和不溶性的二脂酞甘油酯，
后者在菌落周围形成不透明区
（有乳白色
环）
， 此为卵磷脂酶试验阳性。奈格尔（
Naglar
）试验是抗原抗体中和试验用产气荚膜梭菌抗血清，
实际是卵磷脂酶抗血清
（抗体）
涂在琼脂上，
由于抗原
（卵磷脂酶）
抗体中和反应，
使菌落周围不形成不透明区，即无乳白色环，则为奈格尔（
Nag1ar
）试验阳性。这样可确证
该菌能产生卵磷脂酶。























b.
方法：将卵黄琼脂平板底部划分两个区，琼脂的一半均匀涂上产气荚膜梭菌抗血




清，
置
37
℃待干后，
将待检细菌 先在未涂抗血清区划线接种，
然后在有血清区划线接种，
置
37
℃
厌 氧孵育
24
～
48h
、观察结果。

c.
结果：未 涂抗血清的一半平板，菌落周围形成较大的混浊不透明区，表示卵磷脂酶试验阳
性；涂抗血清的一侧，菌 落周围无不透明区（无乳白色环）
，表示卵磷脂酶活性已被抗毒素
所中和，为奈格尔试验阳性； 如两侧菌落周围均无不透明区，表示该菌不产生卵磷

脂酶。产气荚膜梭菌卵磷脂酶试验为阳性，破伤风梭菌、肉毒梭菌为阴性。

(4)
动物实验

①原理：产气荚膜梭菌接种小白鼠腹腔后，可使小白鼠各脏器肿胀、并有许多气泡，

尤以肝脏为甚，故又称为海绵肝或泡沫肝。

②方法：将产气荚膜梭菌培养液
0
．
2
～
1
．
0ml
注射小白鼠腹腔，
5 min
后断髓处死，置
37
℃
孵育
5
～
8h
，观察小白鼠腹腔是否膨胀有气肿现象，然后解剖小白鼠，观察各脏器，尤其是
肝脏的变化。





③结果：剖检可见各脏器肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为 甚，称海绵肝或泡沫肝。如果取
内脏组织涂片，革兰染色、镜检，可见具有荚膜的革兰阳性梭菌。

3.
肉毒梭菌

(1)
形态观察肉毒梭菌为革兰染色阳性、两端钝圆的粗大杆菌，单独或成双排列；菌

体的芽胞为卵圆形，
宽于菌体，
位于菌体次未端，
使细菌呈
―
网球拍
‖
状；
鞭毛染色可见周鞭。

(2)
培养物观察肉 毒梭菌在扈肉培养基中生长旺盛，呈均匀混浊，产生少量气体，肉渣被消
化变黑色，看腐败性恶臭；在血 琼脂平板上呈现半透明、有光泽、边缘薄、弥散而不规则的
菌落，有
β
溶血环。

(3)
生化反应

①五糖发酵试验：将五种糖发酵管与牛乳培养基置水浴 中加热煮沸
10rnin
，迅速冷却。以无
菌吸管吸取肉毒梭菌培养液，
分别 滴加于五糖发酵管与牛乳培养基中，
接种后在液面上加一
薄层熔化的石蜡。经
35C< br>孵育
24
～
48h
，观察结果。

结果：
肉 毒梭菌能分解葡萄糖，
麦芽糖与蔗糖，不分解乳糖与甘露醇，
牛乳培养基一般无变
化。







































②脂酶试验

a.
原理：肉毒梭菌能产生脂酶，它作用于卵黄中游离脂肪，产 生甘油和不溶性游高脂肪酸，
在菌落的周围形成局限的不透明区，并于菌落表面产生一层珠光层。为一薄 层脂肪




酸，
可与卵磷脂的分解产物（二脂酰甘油酯）区别。

b.
方法：将 肉毒梭菌接种于卵黄平板，置
35
℃厌氧孵育
48
～
72h
，观察结果。

c.
结果：菌落表面有珠光层，菌落的周围有不透明区者为脂酶阳性， 各型肉毒梭菌（
G
型除
外）脂酶试验阳性，破伤风与产气荚膜梭菌该试验为阴性。
(4)
动物试验






























①原理：
肉毒梭菌培养液注入小白鼠腹腔后其毒素 作用于颅脑神经核、
外周神经肌接头以及
植物神经末梢，使小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难，眼 睑下垂，瞳孔散大、流涎，最后因心
力衰竭或呼吸困难而死亡。

②方法
< br>a.
准备滤液：取培养
5
天的肉毒梭菌液体培养物，离心
3000r< br>／
min
，
30min
，取上清经滤菌器
除菌，取滤液作试验 。

b.
将动物分为三组：
1
组：
取上述滤液
0. 5m1
，
注入小白鼠腹腔。
2
组：
同法注入加热
100℃
30mm
的滤液于第二只小白鼠，
3
组：第三只小白鼠在注射肉毒梭菌 多价抗毒素的同时再。注射不
加热的滤液。



c.
结果 ：注射后
1
小时（也有延至
3
～
7
天）
，第
1
组小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困




难、眼
睑下垂、瞳孔散大、流涎等中毒症状，最后因心衰或呼吸困难而死亡。剖检，内脏可见明显
充血，大量 出血与血栓形成等，第
2
乃组动物不发病，存活。

4.
临床意义：






破 伤风芽胞梭菌又称破伤风杆菌，
广泛存在于自然界，
在土壤和人与动物的肠道中都有
存 在。
当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带，
破伤风梭菌可侵入伤口生长繁
殖，分泌外毒素，引起机体痉挛性抽搐，称为破伤风，新生儿破伤风又称为脐带风。





产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。
本菌可产生外毒素及 多种侵袭性酶类。
此菌的
致病条件与破伤风梭菌相同，主要是大面积创伤、
局部供血不 足，
组织缺氧坏死，
氧化还原
电势下降）
菌体产生芽胞，
产生毒素和 侵袭性酶，
引起感染致病。
所致疾病主要是气性坏疽，
某些型别也可引起食物中毒和坏 死性肠炎，
也常与兼性厌氧菌混合感染，
引起深部脓肿，
腹
腔、盆腔、胸腔感 染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。

肉毒梭菌广泛存在于自然界， 土壤中常可检出，偶尔存在于动物粪便中。在厌氧环境
中，此菌分泌极强烈的肉毒毒素，引起特殊的神经 中毒症状，
病死率极高。
本毒素尚可使婴
幼儿感染与中毒。本病与典型的食人肉毒毒素 引起的食物中毒不同，属于感染性中毒。

5.
注意事项

(1)< br>对预采集标本部位应首先清除污物、再用
2
％～
2
．
5
％碘酒
75
％酒精消毒，防止皮肤表面
污染菌（需氧菌）混入标本而影响检测结果； 所盛容器必须在用前进行灭菌。

(2)
对不同部位的标本采集，
应分别采取 ，
如系瘘管应取部分坏死碎片，
对闭锁性脓肿



应
以无菌注射器穿刺抽取脓汁和分泌物，取材后尽量排出注射器内空气，并将针头插入无




菌橡皮塞内，避免空气进入。






(3)
对厌氧菌的分离培养、鉴定的全过程中均应防止氧气进入。




























二、
艰难梭菌





（一）目的要求














































1.
掌握艰难梭菌的形态特点及培养特性。




2.
熟悉鉴别艰难梭菌的一般原则和常用方法。

3.
了解艰难梭菌毒素对动物的毒性试验。

（二）器材和试剂

















1.
菌种


艰雅梭菌。

2.
培养基


疱肉培养 基、
CCFA
（环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、果糖、琼脂）平板培养基、卵
黄琼脂培养基 、五糖发酵管、七叶灵柠檬酸铁琼脂、
20
％胆汁心脑浸液、明胶培养基。

3.
试剂


芽胞染色液、焦性没食子酸、
100g
／
L
氢氧化钾、索氏梭菌抗血清、
20g
／
L
尿素、L
一色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4.
其他


家兔、无菌注射器及针头、无菌吸管、滴管、中小试管 、消毒纱布块；固体石蜡、
酒精灯、三角架、消毒用碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水、剪刀、镊子、钯粒 、产气袋、厌
氧罐、水浴锅等。

（三）步骤和方法

1.
形态观察


艰难梭菌为革兰阳性粗长杆菌；芽胞为卵圆形或长 方形，位于次极端或极端、
运动性菌株为周鞭毛。



2.
培养物观察


在
CCFA
平板上，经
48h
厌氧培养后，产生特征性马厩






（
horsestable
）
气味，菌落直径
3
～
5rnm
，圆形、略凸起、白色或淡黄、不透明 、边缘不整齐、表面粗糙或
毛玻璃样菌落。
在紫外线照射下，可见黄绿色荧光；在血琼脂平板上 不溶血；在卵黄琼脂平
板上不形成乳浊环或珠光层。

3.
生化反应


将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸
10rnin
，迅速冷却。以

无菌吸管吸取艰难梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基牛，接种后，在液面






上加一薄层熔化的石蜡。经
37
℃厌氧孵育
24
～
48h
后，观察结果。结果艰难梭菌能分解葡






萄糖和甘露醇产酸；不分解乳糖、麦芽糖和蔗糖；在牛乳培养基上，不凝固和不消化牛乳。

4.
动物试验（家兔肠拌试验）

（
1
）原理：艰难梭菌的 毒素注人家兔小肠后可使肠腔积有大量暗红色棍浊液甚至坏死。

（
2
）方法：




































①准备滤液：用于毒性检测的腹泻粪便标本，先经
1000r
／
min
，
10min
离心沉淀后，取上清
液过滤除菌；疱肉培养基经
37
℃四天的培养液，离心沉淀，取上清液过滤除菌。

②家兔肠拌试验：
取断食两天的家 兔，
剖腹后取出小肠扎成四段，
分别注入
a
待测标本滤液；
b
经
56
℃
30min
加热灭活的滤液；
c
索氏梭菌抗毒素和标本滤液；
d
生理盐水。

24h
后再 行
剖腹、
观察各肠段内的液体贮积量。
若只有注入未经任何处理的待测标本滤液的肠段 内积有
大量暗红色的混浊液；而其它肠段先变化者，判为阳性皮应
.
表
3-1-1





厌氧芽胞梭菌生化反应

















葡萄

乳


麦芽

甘露


蔗


牛


吲


硫化

七叶

明


硝酸盐

卵磷


脂

















糖



糖




糖


醇



糖


乳


哚



氢



灵


胶


还原



脂酶


酶




破伤风梭菌



一



一




一


一



一


d

十一

十一


一


十



一





一



一

产气荚膜梭菌


十



十




十


一



十

cd

一



十




d


十


＋一



十



一

肉毒梭菌






十



一




十


一



一


d


一


十




一


十



一





一



十



艰难梭菌






十



一




一


十



一


一


一


一




十


十



一





一



一






注：＋：阳性；一：阴性；＋一：多数阳性；















牛乳：
d
消化；
c
：凝固；
cd
：既消化又凝固； 一：不消化，不凝固


5.
临床意义















艰难棱菌是人和动物肠道寄生菌。
本菌与假膜性结肠炎有关。
近 年来，
该菌已成为医院
内感染的病原菌之一。除假膜性结肠炎外，艰难梭菌可引起肾盂肾炎、< br>脑膜炎、腹腔及肠道
感染，菌血症和气性坏疽等。

6.
注意事项



(1)
艰难梭菌需要严格的厌 氧条件，因此，从标本采集到培养鉴定全在无氧环境下进行。

(2)
艰难梭菌培养需 特殊培养基（
CCFA
）
，不能用一般培养条件进行培养。

(3) CCFA
培养基按要求制成平板后装人塑料袋内
2
～
8
℃保存，最长 不要超过
8
周。

三、弱类杆菌和产黑色素类杆菌


（一）目的要求




1.
掌握脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌的形态特点及培养特性。

2 .
熟悉鉴别脆溺类杆菌和产黑色素类杆菌的一般原则和常用方法。

（二）器材和试剂



1.
菌种


脆弱类杆菌、产黑色素类杆菌。


























2.
培养基


血琼脂平板培养基、七叶灵柠檬觎琼脂、
z 0
％
LHfr
心脑浸液、明胶培养

基、五糖发酵管、醋酸铅琼脂。











3.
试剂


革兰染色液、
100g
／
L
氢氧化钾、
20g
／
L
尿素、澳甲酚紫、
L
色氨酸、硝酸盐还原
试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。< br>、


4.
其他


无菌吸管、蒸馏水、剪刀、镊子、药勺、把粒、厌氧袋、厌氧袋、水浴锅、真空
泵等。








































（三）步骤和方法






1.
形态观察


脆弱类杆菌为革兰阴性短杆菌、两端圆而浓染、常 并排存在或
3
～
4
个菌体排成
短链。菌体有时细长，弯曲，含一个以 上淡染区，易误为芽胞；多数株有荚膜。产黑色素类
杆菌为革兰阴性短杆菌，呈球形，以球杆状多见，菌 体笔直或略弯曲，有时呈多形性，菌体
较长，两端浓染，着色不均匀，可见短丝状。





2.
培养物观察


脆弱类杆菌在 血平板上生长良好，菌落圆形，直径
1
～
3mm
，中心略。凸起，
半 透明，灰白色，表面光滑，边缘整齐，多数菌株不溶血。




产 黑色素类杆菌在血平板上生长良好，缓慢生长，经
2
～
3
天孵育后菌落直径< br>0.5
～
3mm
，
圆形凸起，灰色或棕黑色，进而呈黑色，不透明）呈
β
溶血。


3.
生化反应

(1)七叶灵水解试验：七叶灵（
eseulin
）的分子式为
C
15
H
16
O
9
，化学名称为
6β
葡萄糖甙

–
7-
二
羟基香豆素，是一种葡萄糖甙。

①原理：细菌产 生七叶灵水解酶，能水解七叶灵（苷）
，产生七叶亭和葡萄糖，加入
5g
／
L
柠檬酸铁后，使铁结合在七叶亭的酚羟基上，生成棕黑色化合物。

②方法：
a
斜面法：
将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别接种在含七叶灵柠 檬酸铁的琼脂斜
面上，经
24
～
48h
厌氧培养，培养基变黑表示七 叶灵已经水解，为阳性。
b
微量斑点法：将七
叶灵
0
．
2g
／
L
（
W
／
V
）水溶液（淡蓝色）滴加于微孔板中 （透明板）三孔，分别加脆弱类
杆菌和产黑色素类杆菌的菌液与蒸馏水
（对照）
37< br>℃

30
～
60min
后，
置
360nm< br>紫外灯下照射，
进行观察。对照孔呈淡蓝色荧光。试验孔，无荧光者为阳性、说明被水解后荧光消 失。与对
照相同者则为阴性。











c.
结果：脆弱类杆菌能水解七叶灵为 阳性反应；产黑色素类杆菌一般不水解七叶灵为阴性反
应。



(2)20
％胆汁（
2
％胆盐）刺激生长试验

①原理：胆 汁能抑制许多厌氧菌的生长，
眉为胆盐可降低细胞膜表面张力，
损伤细胞膜。但
脆弱类 杆菌群和少数其它厌氧菌，却能利用胆汁作为其营养物质，放生长旺盛

②方法（试管法）：将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别以相同菌量接种至胆汁的心脑浸液
（
BHI
）培养基中和不含胆汁的
BHI
对照管。也可用
2
％胆盐
BHI试验。

③结果：含胆汁的
BHi
管中，生长旺盛者，为阳性：抑制生长 者为阴性。不含胆汁管对照，
多为一般生长，为十。脆弱类杆菌胆汁试验阳性，产黑色索类杆菌胆汁试验 为阴性。
(4)
明
胶液化试验

①原理：明胶是一种动物蛋白，能在
20
℃凝固，高于
20
℃时液化；
某些细菌有明胭能使明胶
分解为多肽和氨基酸，即不再凝固。

②方法：
将脆弱类杆菌和产黑色素类杆 菌分别接种于明胶管中，
另外放一未接种






的明
胶管对照，缉
37
℃
2
～
5
天孵育，取出置冰箱（
4
℃）中
30ini
山仍不凝固者为阳性，凝固者为
阴性；而对照管
37
℃时呈液化状态，
4
℃冰箱中应凝固。

③结果：脆弱类杆菌明胶液化试验为阴性，产黑色素类杆菌明胶液化试验为阳性。


4.
临床意义





脆弱类杆菌群存 在于人及动物的大肠中，
是健康人粪便中的正常菌群，
每克粪便中约有
10
1 0~12
个，为大肠埃希菌的
100
～
1000
倍。是厌氧菌感染中 最常见的菌之一。主要为内源性
感染。也可见于女性生殖系统、脓胸、颅内感染及菌血症等。







产黑色素类杆菌群可单独引起感染，
但更常见与其它厌氧菌、
需氧菌或兼性厌氧菌引
起的混合感染。
在正常情况下 ，
本群细菌存在于人体口腔、大肠和阴道，组成这些部位的正
常菌群。女性生殖道及口腔感染较 为多见。是仅次干脆弱类杆菌群的常见菌。

5.
注意事项

(1 )
在采集标本时应注意标本的特征，
如恶臭；
这是厌氧菌终末代谢产物所产生的，尤




其
是梭杆菌和产黑色素类杆菌；砖红色荧光 ，这是产黑色素类杆菌产生的原叶琳所致；黑






色坏死组织或黑色分泌物，一般是由产黑色素类杆菌所造成的。

(2)
B BE
琼脂平板有利于快速分离和初步鉴定脆弱类杆菌群，
KVLB
可用以选择带色素的 或
其他类杆菌。

(3)
胞外酶快速生化试验，由于细菌不需要再繁殖，故亦 不需厌氧培养，只需在有氧条件下
置
35
℃孵育
4h
，即可观察结果

附录

常用培养基

1
．疱肉培养基


牛肉渣




0
．
5g














牛肉汤

















7m1








取制备牛肉浸液剩下的并经过处理的肉渣，装于
15mm×
150mm
试管，每管
0
．
5g
，并
加入< br>pH7
．
6
的肉汤培养基
7m1
，
上盖
3< br>～
4mm
厚的融化凡士林，
经
103
．
43kPa< br>高压灭菌
15min
后备用。

2
．卵黄琼脂





胰酪胨










40g






葡萄糖



















2g





磷酸氢二钠








59







琼脂




















20g





氯化钠












2g






500g/L
硫酸镁











0
．
2m1





蒸馏水









1000ml





将以上成分 加热溶解，调
pH7
．
3
至
7
．
4
，103
．
43kPa
高压灭菌
15min
，冷至
60< br>℃加入
500g/L
蛋黄盐水
100m1
，混匀倾注平板。
4
℃保存备用。


3
．溴甲酚紫牛乳培养基






















新鲜牛奶（脱脂）
100m1








16g/L
溴甲酚紫溶液



0
．
1ml




将澳甲酚紫指示剂 加入牛奶中，分装试管，每管约
5m1
，于表面加已融化的凡士林，厚
约
5m m
。
55.16kPa
高压灭菌
20min
后经
37
℃
24
～
48h
，若无细菌成长即可使用。

4
．糖发酵培养基




胰蛋白胨












15g








维生素
C










0
．
1g



酵母浸出粉











7g







硫乙醇酸钠








0. 5g



L
一半胱氨酸








0
．
5g





溴甲酚紫










0
．
01g



氯化钠














2
．
5g





蒸馏水












1000nll




上述基础培养液按
10 g
／
L
加入所需的糖，即成各种糖发酵管。分装后，经
68
．
95kPa
高
压灭菌
20min
后备用。






5
．心脑浸液（
BHI
）及心脑浸液血琼脂







牛脑浸出液








200ml







磷酸氢二钠













2
．
5g






牛心浸出液








250ml








半胱氨酸














0
．
5g


琼脂
















10g








氯化血红素（
5g
／
L
）







1ml






酵母浸出物（粉）





5g







维生素
K10g
／
L
溶液





0
．
1ml






葡萄糖















2g







氯化钠


















5g






蒸馏水














1000m1




牛心脑浸出液的制备： 将去筋膜并绞碎的牛脑和牛心各
500g
分别置于两只
2000ml
的三角烧瓶中，
各加
1000ml
蒸馏水。
4
℃置冰箱过夜。
次日撇去浮油，
分别置
45
℃水浴中加温
1h
，
再煮沸< br>30min
，用纱布过滤。不易滤清时，再置冰箱待杂质沉降，吸取上清液。各补足水分
至
1000m1
，
103
．
43kPa
高压灭菌
1 5min
，后备用。





将已制备的牛心脑 浸液和上述成分加入容器内，加蒸馏水至
1000ml
加热溶解，冷却后
调
p H
至
7
．
6
～
7.8
。分装后
103．
43kPa
高压灭菌
15min
。


< br>牛心脑浸液琼脂与血琼脂：上述牛脑浸液基础培养基加入
2
％琼脂，即为心脑琼脂。
在心脑琼脂中加入
5
％～
10
％脱纤维羊血，即成心脑血琼脂 。

6
．七叶灵琼脂培养基




糖发酵基础液（无指示剂）
1000m1







柠檬酸铁







0.5g




七叶灵




















1g










琼脂











15g
7
．


20
％胆汁培养基及其对照管
























胆汁管：蛋白胨酵母葡萄糖（
PYG
）或硫乙醇酸盐基础液
100m1






牛胆粉（或胆汁）






2g






去氧胆酸钠












0
．
1g








对照管：
PYG
或硫乙醇酸盐基础液
100mI




胆汁管的各成分混合，加热溶解，调整
pH
至
7
．
5
分装小试管，每管
2m1
。对照管中培养
基也调整
pH
至
7
．
5
。
68
．
95kPa
高压灭菌
15min
后备用。

8
．硫乙醇酸盐（
TH10
）培养基







胰酶解酪蛋白






17g









半肮氨酸













0.25g






植物胨或大豆胨




3g










亚硫酸钠













0.1g






葡萄糖












6g










0.5
％氯化血红素溶液


1m1






氯化钠












2.5g









10g
／
L
维生素
K1
溶液

0.1m1






硫乙醇酸钠








0.5g









琼脂












0.7g






蒸馏水












1000ml




混合上述各成分加热至完全溶解，煮沸
1
～
2min< br>，冷却后调整
pH
至
7
．
2
～
7
．
4
。分装后
置
103.43kPa
高压灭菌
15min，
4
℃保存备用。


9.

CDC
厌氧血琼脂






















胰酶解酪蛋白











15







10g
／
L
氯化血红素


0
．
5m1





植物胨或木瓜酶消化豆粉

5g







10g
／
L
维生素
K



1m1
氯化钠
















5g







半腕氨酸











400mg





琼脂



















20g






脱纤维羊血或兔血



50m1





酵母浸出粉













5g







蒸馏水













1000ml
①将上述成分（除血液外）混合，加热溶解，冷却后调整
p H
至
7
．
4
。②
103
．
43kPa高
压灭菌
15min
，冷却至
50
℃，加入无菌脱纤维羊血或兔 血
50m1
，混匀后倾注平板。

10
．明胶培养基


硫乙醇酸盐及其他基础培养基加
50g/L
明胶即成。

11.
L-
色氨酸基质

10g
／
L
色氨酸加
5ml
0.025mol
／
L
pH7.4
的磷酸盐缓冲液
100ml,
过滤除
菌，分装每管0
．
5m1
，
4
℃保存。

12
．糖发酵缓冲液

磷酸氢二钾




0.04g













磷酸二氢钾






0
．
01g



氯化钾








0
．
8g












10g/L
酚红水溶液

0.2m1




将上 述成分加蒸馏水至
100m1
，过滤除菌，
4
℃保存备用。

13
．
0.025mol
／
L
磷酸盐缓冲液





（
1
）
原液：
A
液：
Na
2
HPO
4
·
2H
2
0

35
．
6g
加蒸馏水至
1000ml
；
B
液：
NaH
2
P0
4
·
H
2
O 27.
6g
加蒸馏水至
1000m1.





(2)
应用液：
①
0
．
025mol pH6
．
0
酚红磷酸盐缓冲液
A
液
6.15ml
＋
B
液
43.85m1
十蒸馏水
350ml
＋
1g
／
L
酚红

0.8m1
，混匀，过滤除菌，
4
℃保存。②
0. 025mol
／
L pH6.8
磷酸盐缓冲
液：
A
液
24
．
5ml
＋
B
液
25
．
5ml＋蒸馏水
350m1
，混匀，过滤除菌
,4
℃保存。③
0
．

025mol
／
L pH7
．
4
磷酸盐缓冲 液
:A
液
40
．
5ml
＋
B
液
9 .5ml
＋蒸馏水
350ml
，混匀，过滤除菌，
4
℃保
存 。

14
．

CCFA
培养基（环丝氨酸
-
头孢甲氧噻吩
-
果糖
-
蛋黄琼脂）





际胨
2
号











40g





琼脂













20g




磷酸氢二钠








5g







1
％中性红酒精溶液
3m1




磷酸二氢钾








1g







环丝氨酸










500mg




氯化钠












2g







头孢甲氧噻吩






16mg




无水硫酸镁








0.1g





50
％蛋黄盐水悬液



50m1




果糖














6g







蒸馏水








加至
1000m1




除环丝氨 酸、头抱甲氧噻吩、
50
％蛋黄盐水悬液外的上述成分，混合加热溶解，调
pH
至
7
．
6
，
103
．
43kPa
高压灭 菌
15min
。冷至
50
℃，以无菌操作加入环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、50
％蛋黄盐水悬液，混匀后倒平板备用。





50
％蛋黄盐水悬液的制备：取新鲜鸡蛋一只，置
70
％酒精中浸泡
15min
消毒，用无菌技
术敲碎蛋壳一端，倒出蛋清后，
将蛋黄倒人灭菌筒内，加入 等量无菌盐水，
用无菌玻棒搅匀
后，即为
50
％蛋黄盐水悬液。

15
．

BBE
琼脂平板（类杆菌
-
胆汁
-
七叶灵）







柠檬酸铁铵








0
．
5g

















植物胨







5g






氯化血红素溶液



5mg
／
ml
）
2ml











胰酪胨






5g






庆大霉素溶液




（
40mg
／
ml
）
2
．
5ml






七叶灵






1g






牛胆粉












20g




















琼脂








15g






氯化钠













5g




















蒸馏水






1000m1
上述各成分混合，加热溶解，调整
pH7
．
0
，
103
．
43kPa
高压灭菌
15min
，备用。
16
．卡那
-
万古霉素血琼脂（
KVLB
）













将
CDC
厌氧琼脂经高压灭菌后，冷却至
50
℃，加入无菌脱纤维兔血（
5
％）
，卡那霉
素（
100ug/m1< br>）和万古霉素（
7
．
5ug/ml
）
，混合后倾注平皿备用。














































（姚淑娟）
















实验五


棒状杆菌属



（一）目的要求



1
．掌握白喉棒状杆菌形态、常用染色方法、鉴别培养基及菌落特点。



2
．熟悉白喉棒状杆菌鉴定试验和测定白喉毒素常用方法。



3
．熟悉白喉棒状杆菌与类白喉棒状杆菌的鉴别要点。


（二）器材和试剂



































1
．菌种


白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌。



2
．
培养基


吕氏血清斜面、血液琼脂平板、
尿素卵黄双糖琼脂斜面、
单糖或糊精培养基、
亚碲酸钾血液琼脂平板、
Ele k
平板等。



3
．试剂


革兰染色液、
Albert
染色液、
Neisser
染色液、白喉抗毒素（< br>DA
T
）
。



4
．其他


1ml
注射器、剃刀、豚鼠或家兔。

（三）步骤和方法


1
．形态观察






















































（
1
）取白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌或模拟白喉咽拭子，涂片、固定、 染色。典型的白
喉棒状杆菌为革兰染色阳性，
一端或两端膨大呈棒状；
Neisser
染色菌体呈棕黄色，
异染颗粒
呈棕褐色、菌体呈
X
、
Y、
W
、
N
、
M
等字母形或栅栏状排列。
（
2
）
Albert
染色方法：在涂片上滴甲液
5min
后水洗，用乙液染
1min
后水洗。干后镜检，可
见菌体呈草绿色，异染颗粒呈紫褐 色，菌体排列同
Neisser
染色所见。

2.
菌落观察


将白喉棒状杆菌分别接种于血平板、亚蹄酸钾血液琼脂平板、吕 氏血清斜面
或凝固鸡蛋清斜面。置
35
℃孵育
18
～
24h
，可在血平板上长出白色不透明菌落，本菌轻型菌
株的菌落有狭窄溶血环，
其余无溶血 现象；
在亚蹄酸钾血液琼脂平板上的菌落呈黑色；
在吕
氏血清斜面或凝固鸡蛋清斜面上 可长出细小灰白色而有光泽的圆形菌落。

3.
生化反应

将白喉棒状杆菌和其他（类白喉）棒状杆菌分别接种于明胶培养基、血清糖
发酵管（葡萄糖、麦芽糖 、蔗糖、糊精）
、尿素卵黄双糖琼脂斜面（先行穿刺接种，后在斜
面划线接种）
。置< br>35
℃孵育
18
～
24h
，观察结果（见表
3-2- 1
及表
3-2-2
）
。若呈阴性反应则延长
至
72h
观察结果。

















表
3-2-1




白喉棒状杆菌和其他常见棒状杆菌的生化反应

















触酶


硝酸盐还原


明胶液化


葡萄糖


麦芽糖


蔗糖


糊精


白喉棒状杆菌




十






十










—







十






十





一




十


干燥棒状杆菌




十






十










一







十






十





十




一


溃疡棒状杆菌




十






一








一／十





十






十





一




十

表
3-2-2




尿素卵黄双糖琼脂斜面上不同棒状杆菌的鉴别

























底层（葡萄糖）








斜面（蔗糖）



白喉棒状杆菌















黄色














不变色


干燥棒状杆菌















黄色














黄色


溃疡棒状杆菌















红色














红色



4.
血清学试验

（
1
）琼脂平板毒力试验：又称
Elek
平板毒力试验。

1
）原理：白喉抗毒素与白喉毒素在琼脂中扩散，在相遇处发生特异性结合，形成肉眼可见的沉淀反应。用作白喉棒状杆菌毒力试验。

2
）方法：①将
E1ek< br>培养基加热融化，冷至
50
～
55
℃，加入
2ml
无 菌小牛血清或兔血清（经
60
℃

30min
灭活）
，混匀 后倾注于无菌平皿中；②在琼脂尚未完全凝固前，将已浸有
1000u
／
ml
白喉抗毒素（
DA
T
）的无菌滤纸条（
60mm
×
10mm
）平铺于平板中央，然后将平板反
扣于
35
℃（孵育箱）
45min
，以烘干表面水分；③用接种环分别取已知产毒素阳性菌、阴性
菌和待检菌的大量菌苔，从滤纸 条边缘垂直划线至平皿壁，划线宽为
6
～
7mm
，纸条两侧可
分别接 种
3
～
4
个菌株，各菌株间距
10
～
15mm。将平板置
35
℃孵育
24h
、
48h
及
72 h
，观察结
果。

3)
结果和意义：
经
35C孵育
24
～
48h
，
若菌苔两侧出现斜向外侧延伸的乳白色沉淀 线，
并与邻
近的阳性产毒株产生的沉淀线相吻合，可判断为产毒株。无毒株经
72h< br>仍不出现沉淀线。

（
2
）
SPA
协同凝集试验：

1
）原理 ：葡萄球菌
A
蛋白能非特异地与
1gG
的
Fc
段结合，而< br>1gG
的
Fab
段又能与相应抗原结
合，形成抗原
-IgG-
葡萄球菌三者交互连接，出现肉眼可见的协同凝集反应。

2
）方法：将待检 培养物的上清液滴加于洁净载玻片上，滴加结合有
DAT
的
SPA
诊断试剂，
混匀并静止片刻后观察结果。


3
）结果和意义：若培养物上清液有白喉毒素
,
即可与
SPA- IgG-DAT
结合，出现肉眼可见的
凝集反应。


































（
3
）对流电泳：
















1
）原理：将抗原（白喉毒素）置于负极，抗体（
DA
T
）置于正极 ，在电场中二者各自向
对方泳动，经一定时间后二者相遇，并在比例合适的部位形成肉眼可见的乳白色沉 淀线。



2
）方法：将
DAi
和待检菌培养物 上清液分别加于琼脂板的两孔内，将
DAT
孔的一端置正
极，
培养物上清液孔 的一端置负极，
在电流
4mA
／
cm
、
电压
6～
10V
／
cm
的条件下电泳
45min
，
判 读结果。



3
）结果和意义：若两孔间出现沉淀线，表示该待检菌为产毒菌株。



4
）用途：本法简便快速，比
E1ek
试验敏感
10～
100
倍，适用于大量标本检测白喉外毒素。


5
．动物试验

（
1
）原理：白喉外毒素可使敏感动物组织 损伤以致死亡。若体内含有一定量的抗毒素，可
中和进入的毒素，
因而不出现局部组织的病变，
使动物免于死亡，
通常用豚鼠或家兔作为试
验动物。

























































































（
2
）方法：








1
）取
16
～
18h
吕氏血清斜面或 尿素卵黄双糖琼脂斜面上的纯培养，加肉汤
1ml
，制成悬液，
用无菌吸管吸此菌液< br>0.5ml
加
3.5ml
肉汤混匀后即可使用。


2
）选体重
250g
左右健康全白色豚鼠两只，一只在试验前
24h
腹腔注射
DAT
1000U
，使其获
得免疫作为对照动物，
另一只 不注射
DA
T
作为试验动物。
接种前将豚鼠腹部朝上固定于架上。
温 水洗净腹部后剃毛（不可刮破皮肤，也不要消毒皮肤）
。剃毛后再用生理盐水棉球擦洗一
次，干 后用
1ml
注射器吸取细菌悬液，分别注射
0.1m1
菌液于试验和对照豚鼠 腹壁皮内。为
防止菌株毒力太强使动物致死，接种
4h
后给试验动物注射
DA T400U
。通常每只豚鼠可接种
6
～
8
份标本；注射后
2 4h
、
48h
和
72h
分别观察皮内反应。




3
）结果：产毒阳性菌株为阳性反应
24h
左右在腹壁 注射部位出现红肿，
48h
红肿部位边缘呈
化脓性病变，
72h
后可 见硬块，并出现灰色坏死斑。
不产毒株呈阴性，
72h
后注射部位元明显
病变 。
若试验动物及对照动物的接种部位均有病变出现，
则结果为可疑，
可能因注射量过多
或抗毒素量过少或失效所致，应重新试验。


4
）用途：动物试验 在临床检验工作中较少使用，仅用于检查
ELek
平板毒力试验结果可疑
者。

（

四）临床意义




本菌属中的白喉棒状杆菌以外毒素为主要致病物质，是呼吸道传染病白喉的病原菌。

白喉外毒素侵入血流可引起心肌和神经系统损害。
除白喉棒状杆菌之外的其他棒状杆菌统称
为类 白喉棒状杆菌，有些为条件致病菌，可引起机会感染。



（五）

注意事项







为保持 白喉棒状杆菌毒力，细菌培养物在室温中搁置时间不超过
2h
，在
4
℃不超过
4h.
毒力试验除用新分离菌株外，须有标准菌株（中间型
park

William

N0.8
菌株）作对照。

附录





1
．吕氏血清斜面

（
1
）成分：
100g
／
L
葡萄糖肉汤（灭菌，
pH7
．
4
）
1
份小牛血清（或兔、羊、马血清）
3
份。

（
2
）配制方法：



1
）用无菌操作法将上述成分混合于灭菌三角烧瓶
.


2)
无菌分装于
15rnm
×
150mm
灭菌试管，每管
3
～
5m1
。



3
）将试管斜置于血清 凝固器内，间歇灭菌
3
天。第
1
天徐徐加热至
85
℃，维持
30min
，使
血清凝固，置
35
℃温箱过夜；第
2
天和第
3
天再用
85
～
90
℃灭菌
30min< br>，取出后置
4
℃备用。


（
3
）用途：用于白喉棒状杆菌培养。



2
．亚碲酸钾血琼脂平板


（
1
）
成分 ：
pH7
．
6
营养琼脂
100ml
，
10g
／
L
亚碲酸钾水溶液
2ml,50g
／
L
胱氨酸水溶液< br>2m1
，
脱纤维丰血或兔血
5
～
10m1
。


（
2
）配制方法：将
pH7
．
6
营养琼 脂熔化，待冷至
50
℃左右，加入已灭菌的亚碲酸钾溶液，
眺氨酸溶液及脱纤维血液， 摇匀后即刻倾注无菌平皿，凝固后置
4
℃备用。


（
3
）用途：用于白喉棒状杆菌培养。


3.
尿素卵黄双糖琼脂斜面


（
1
）成分：营养 琼脂（
pH7
．
8
～
8
．
0
）
1 00m1
，
1g
／
L
酚红溶液
2
．
5ml
，
200g
／
L
蔗糖溶
液
5m1
，
100g/L
葡萄糖溶液
1m1
，
200g
／
L
尿素溶液
lml
，新鲜鸡蛋黄（无菌取出）
1
个。


（
2
）配制方法：




1
）取营养琼脂熔化后加入酚红，高压蒸汽灭菌
103
．

43kPa

15min
，置
70
℃水浴中备
用。




2
）将蔗糖、葡萄糖、尿素等溶液混匀，加人卵黄
1
个，混匀后加 入上述营养琼脂，充分
混匀。






























3
）无菌分装制成高层斜面，待凝固后作无菌试验 ，如仍保持原来的鲜明淡红色即置
4
℃
备用；如培养基已变淡黄色，表示有污染，不可 使用。



（
3
）用途：用于白喉棒状杆菌鉴别培养
.



4
．

ELek
培养基



（
1
）成分：





1）甲液：胰蛋白胨
4.0g
、麦芽糖
0
．
6g
、纯乳酸
0
．
14m1
、加蒸馏水至
100m1
。





2
）乙液：琼脂
3
．
0g
、
NaCl 1
．
0g
加蒸馏水至
100m1
。




（
2
）配制方法：





1
）将甲、乙液中各成分分别加入蒸馏水中，加热溶解，用脱脂棉过滤后校正
pH为
7.8
。





2
）将甲、乙液等量混合，分装试管，每管
15m1
。

3
）置试管于阿诺灭菌器，
100
℃

20
～30min
间歇灭菌（同吕氏血清斜面）
，置
4
℃备用。
使用时 将熔化后冷至
55C
的
Elek
琼脂按
5
：
1的量加入无菌正常兔或牛血清，充分混匀倾注无
菌平皿，凝固后即可使用。



（
3
）用途：用于自喉棒状杆菌毒素测定。





























































（姚淑娟）

实验六


需氧芽胞杆菌属



一

蜡样芽胞杆菌


（一）目的要求





1.
熟悉蜡样芽胞杆菌形态染色、菌落特点、常用生化反应及鉴定试验、活菌计数方法。




















2.
了解蜡样芽胞杆菌肠毒素测定方法。


（二）器材和试剂


1.
菌种



蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。


2.
培养基


营养琼脂、血液琼脂、卵黄琼脂，葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷、乳
糖、甘露醇、木糖 等糖发酵管，葡萄糖蛋白胨水、柠檬酸盐培养基、醋酸铅明胶培养基。

3.
试剂


吲哚试剂、
50
％
a-萘酚酒精溶液、
含
3g/L
肌酸的
40
％
KOH
、
鞭毛染色液、






3
％
过氧化氢。

4.
动物


小鼠、家兔。

（三）步骤和方法
















1.
形态观察


将待检标本（如食物中毒剩 余食物）或纯培养物涂片，作革兰染色，可见两
端钝圆、链杆状排列的革兰阳性大杆菌，
无荚膜 。
培养
6h
后可形成小于菌体的圆形芽胞。鞭
毛染色可见有周鞭毛。

2.
菌落观察


将可疑食物或培养物加适量生理盐水研磨后划线接 种于普通平板和血液琼脂
平板，
35
℃孵育
18
～
24h< br>。在普通营养琼脂上形成圆形凸起的菌落，表面粗糙有蜡光，不透
明，似毛玻璃。
血液琼 脂平板上菌落周围形成。溶血环。
在卵黄琼脂平板上菌落周围形成乳
白色混浊环。





































3.
生化反应
































（
1
）碳水化合物试验：将蜡样芽胞杆菌分别接种于葡萄糖、麦芽糖、糊精 、蔗糖、水杨苷、
乳糖、
甘露醇、
木糖等糖发酵管和葡萄糖蛋白胨水、柠檬酸盐培养基 上，
35
℃孵育
18
～
24h
，
观察结果。该菌能 分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷产酸不产气，不分解乳糖、甘
露醇，不产生吲哚，触酶、VP
试验阳性。




（
2
）含氮 化合物试验：将蜡样芽胞杆菌接种于醋酸铅明胶培养基，经
35
℃孵育
18
～





24h
，观察结果，该菌
H
2
S
阴性、明胶液化。

（
3
）乳光反应

①原理本菌能产生卯磷脂酶，在有
Ca< br>2+
存在时，能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和

水溶性磷脂胆碱，故在菌落周围出现乳白色混浊环，称乳光反应或卵黄反应
.

②方法：用接种针挑取可疑菌落点种在
10
％卵黄琼脂平板上，
35
℃孵育
3h
。

③结果和意义
3h
无菌落生长，
但在点种 处可出现混浊环，
6h
后混浊环直径可扩大至
5
～
6mm
。
用于测定细菌能否产生卵磷脂酶，也可以此来计数菌落。

（
4
）触酶试验：阳性
.



本菌与枯草芽胞杆菌的不同点是不分解木糖，
与炭疽芽胞杆菌的不同点是能迅速液化明
胶， 利用柠檬酸盐。













4
．动物试验

（< br>1
）毒力试验：将研磨过的可疑食物或培养物
0
．
3
～
0
．
5ml
接种于
18-20g
小白鼠腹腔内，
小白鼠于 接种后
12
～
18h
内死亡，解剖死亡小归鼠，取心血涂片，作革兰染色，可 见蜡样芽
胞杆菌典型形态。

（
2
）毒素测定：蜡样芽胞杆菌不同菌 株产生不同类型的肠毒素。可用家兔肠管结扎试验鉴
定。
产生呕吐型肠毒素的菌株家兔肠管结扎 试验阴性，
而产生腹泻型肠毒素的菌株肠管结扎
试验阳性。

5.
活菌计数


将残余食物用生理盐水稀释成
10
-1
～
10
-3
。


（
1
）
乳光反应计数法：
取各稀释度的悬液
0.1ml
以
L
形玻璃 棒均匀涂布，
接种于卵黄琼脂平
板上，置
35
℃孵育
6h
， 本菌在此平板上产生乳光反应，易于识别。

6.
常用
10
％卵黄琼脂培养基





（
1
）成分：
50
％卵黄盐水
20m1
，
pH7
．
4
营养琼脂
100m1
。

（
2
）配制方法：将营养琼脂加热熔化，待冷却至
55C
左右，以无菌技术加入
50
％卵黄盐水
悬液，混匀后倾注于无菌平皿内，凝固后置
4
℃备用 。

（
3
）用途：用于测定蜡样芽胞杆菌的脂酶。


二

炭疽芽胞杆菌

（一）目的要求








































1
．熟悉炭疽芽胞杆菌形态染色和菌落特点。

















2
．了解炭疽芽胞杆菌生化反应及具有鉴定意义的常用试验和方法。

（二）

器材和试剂























1
．菌种


炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌。
















2
．培养基


营养琼 脂、血液琼脂、
0
．
5
％
NaHCO
，
、
10
％马血液琼脂、含
0.05
～
0.5IU
／
m1
、
5IU
／
m1
、
10IU
／
m1
和< br>100IU
／
m1
的青霉素琼脂、戊烷眯琼脂、各种生化反应培养基。


3.
试剂


青霉素
1IU
／片纸片、
AP
631
炭疽芽胞杆菌噬菌体

（三）

步骤和方法


























1
．
形态观察


本菌是菌体两端平截呈矩形、
短链状或竹节状排列的革兰阳性大杆






菌，
无鞭毛、芽胞椭圆形小于菌体，在陈旧培养物 中可见游离的芽胞，有毒株可形成荚膜。


2
．菌落观察

（
1
）普通琼脂平板：接种本菌后经
35
℃孵育
18
、< br>24h
可生成直径
2
～
4mm
、扁平粗糙、不透
明灰 白色、无光泽、边缘不整齐的菌落，在低倍镜下可见到菌落呈卷发状。

（
2
）血液琼脂平板：接种本菌后经
35
℃孵育：
12
～
15h
，出现不溶血菌落，
18
～
24h
后可有
轻微溶血。















































（
3
）重碳酸盐平 板：将有毒株接种于
NaHCO3
血琼脂平板，置
5
％
CO
2
环境中，
35
℃

孵育
18-24h
，可产生荚 膜，菌落由粗糙型（
R
）变为粘液型（
M
）
，而呈现半圆形，凸起， 有光泽
的菌落。以接种针挑取菌落可出现拉丝现象。卷发状菌落和菌落拉丝现象是本菌的鉴








别要点。






（
4
）
戊烷眯琼脂平 板、
接种本菌经
35
℃孵育
18
～
24h
后可见灰 白色不规则圆形，
表






面粗糙，呈卷发状的菌落，刚从孵育箱中取出时不溶血，
24h
后有时会出现轻微溶血现象本 菌
的无毒株为粗糙型菌落，有毒株为光滑型菌落。



3
．生化反应


将本菌接种于葡萄糖、麦芽糖、果糖、硝酸盐、葡 萄糖蛋白胨水、明胶、
尿素、柠檬酸盐等培养基，
35
℃孵育
18
～
24h
，观察结果，本菌分解葡萄糖、麦芽糖果糖产
酸不产气，触酶阳性，能还原硝酸 盐、
vp
试验和脲酶阴性，不液化明胶，不利用柠檬酸盐。



4
．血清学试验


炭疽热沉淀反应，又称
Asco1i
试验。





取死亡病畜的腐败的脏器、
皮毛、
肉食及其制品剪碎，
加入
5
～
10
倍生理盐水、
先浸泡
2
～
3h
，再在沸水中煮
5
～
15min
，用滤纸过滤，滤液即为沉淀原。取
3
支沉淀管，吸取炭疽沉淀
血清
0.5ml
加入第
1
、2
管中，第
3
管加正常兔血清对照；吸取上述沉淀原，沿管壁轻轻加入第
1
、
3
管中，
勿混匀；吸取正常组织或皮毛滤液加入第
2
管 中作为正常抗原对照。
如第
1
管界面
出现白色沉淀环，即为阳性。



5
．
动物实验


取纯培养物接种于 肉汤培养液，
35
℃孵育
18
～
24h
，
吸取0
．
1ml
接种




于
小鼠皮下，小鼠于
72-96h
发病并死亡。解剖后可见接种部位呈胶样水肿，肝脾肿大出血， 血
液呈黑色且不凝固。取心血、肝、脾涂片染但镜检，可检出本菌。将肉汤培养物
0.2m1< br>接种
于豚鼠或家兔；
该动物于
48~72h
死亡，
解剖所见同 小鼠，
蜡样芽胞杆菌对豚鼠或家兔无致病
力。


6
．重要鉴定试验












（
1
）
噬菌体裂解试 验：
将一接种环待检肉汤培养物（经
35
℃孵育
4
～
6h< br>）
，
涂布于营养琼脂
平板，
干后将
AP
631
炭疽芽胞杆菌噬菌体滴于平板中央或划一直线，
于后置
35
℃孵育
18h< br>出现
噬菌斑或噬菌带者为阳性。每份标本应作
2
～
3
个同样的 试验，同时滴种肉汤液作阴性对照。



















（
2
）串珠试验：将待检菌接种于
0
．
05
～
0
．
5IU
／
ml
青霉素的培养基，35
℃孵育
6h
后。取
菌涂片染色，
可见炭疽芽胞杆菌形态发生 明显变化，
形成大而均匀成串的圆球状菌体，
即串
珠试验阳性。蜡样芽胞杆菌无此反应 。


（
3
）青霉素抑制试验：将待检菌分别接种于含青霉素
5
、
10
、
100IU
／
ml
的青霉素琼脂平< br>板，
35
℃孵育
18
～
24h
。炭疽芽胞杆菌能在含
5IU
／
ml
的青霉素琼脂平板上生长，在含
10
、
100IU
／
ml
的青霉素琼脂平板上受抑制而不能生长。

< br>（
4
）串珠和青霉素抑制联合试骏：将待检菌新鲜肉汤培养物
0
．1ml
滴于预温的
2
％血清琼
脂平板的一半，
另一半滴力加蜡样 芽胞杆菌新鲜肉汤培养物
0
．
1m1
，分别用灭菌
L
形玻璃 棒
涂布，干后将含青霉素
1IU/
片纸片贴于其上，
35
℃孵育2h
左右，打开平皿置低倍镜下观察，
可见药物纸片周围有一无菌生长的抑菌环，
其周围由于青霉素浓度低；
菌体细胞壁受损而成
为串珠。
观察完毕继续置
35
℃孵育
8
～
12h
，
测量抑菌圈直径。
炭疽芽胞杆 菌出现明显抑菌圈、
串珠试验阳性而蜡样芽胞杆菌无此反应。

三

产单核李特菌

（一）目的要求

1.
熟悉产单核李斯特菌形态学和菌落特点。


2
．了解产单核李斯特菌的主要生化反应和兔眼结膜毒力试验。

（二）器材和试剂

1.
菌种


产单核李斯特菌。

2
．培养基


营养琼脂、血 液琼脂、萘啶酸琼脂、亚碲酸钾血琼脂，葡萄糖、麦芽糖、七叶
苷、
果糖、
水杨酸、< br>乳糖、
蔗糖、
糊精等各种糖发酵管及葡萄糖蛋白胨水、
尿素、
明胶



和
硝酸盐还原培养基。

3
．试剂


甲基红试剂、
α
一萘酚酒精溶液、含
3
％肌酸的
40
％
KOH
、
3
％
H
2
0
2
溶液。

4
．动物


幼兔。

（三）步骤和方法

1
．形态观察


取产单核李斯特菌涂片染色镜检，该菌为革兰阳性小杆菌，多形态，菌体直
或稍弯， 常呈
―
V
‖
字形成对排列，或呈丝状，多数菌体一端较大，似棒状，易误认为 污染的
类白喉棒状杆菌，
有时短小的菌体三五成链，
似链球菌。
该菌有鞭毛，
无芽胞，
不形成荚膜，
在陈旧培养基上可转变为革兰阴性，两端浓染，易误判为革兰阴 性双球菌。

2
．
菌落观察


将产单核李斯特菌 接种普通平板和血琼脂平板，
经
30
～
35
℃孵育




18
～
24h
，
菌落极小呈露滴状 ，且透明光滑，侧光微显蓝绿色
J5C
孵育数日可形成直径




2mm
的灰暗
菌落。在血琼脂平板上，菌落有狭窄的
p
溶 血环。接种在蔡陡酸选择平板上，




经
35C
孵
育数日，可见直径
0
．
2
～
0
．
8m m
边缘整齐、表面细密湿润的蓝色圆形菌落。在亚蹄酸钾血
琼脂平板上可形成黑色菌落。

3
．生化反应


本菌分解葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、果糖、水 杨酸产酸不产气，触酶阳性，
MR
、
VP
试验阴性，在
3
～
10
天内可迟缓发酵乳糖、蔗糖和糊精产酸不产气，吲哚、脲酶试
验阴性，不液化明胶 ，不还原硝酸盐。

4
．血清学试验


本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等多数革兰阳性菌及大肠埃




希
菌有共同抗原，故血清学试验无鉴别意义。




5
．
动物试验


兔眼结膜毒力试验。
将本菌
18h
肉汤培养物滴入幼兔眼结膜，
24
～
36h



内
引起化脓性角膜结膜炎，若角膜混浊，结膜水肿且有渗出物，即为阳性 ，在渗出物涂片和




培养中均可查到此菌。

（四）临床意义







本菌属常经胎盘、
产道感染，
引起流产和新生儿脑膜炎；眼、皮肤与病畜接触可发生
局 部感染，
甚至发展为败血症和心内膜炎等。
近年报道因病畜污染牛奶和乳酪等可引起食源






性感染的流行。


常用萘啶酸琼脂培养基

（
1
）成分：营养琼脂
200m1
、
，
10g/L
萘啶酸
2m1
。

（
2
）配制方法：将营养琼脂熔化后加入萘啶酸即成。































































（姚淑娟）