怀孕hcg正常值对照表-
目
录
中文摘要................................................ ............
2
Abstract
..... .................................................. ...
3
引言
.......................... ......................................
4
1
材料与方法
............................... .........................
5
1.1
材料
.............................................. ..............
5
1.1.1
病料
..... .................................................. ...
5
1.1.2
鸡胚、鸡红细胞
....... .........................................
5
1.1.3
主要试剂
.................. ....................................
6
1.1.4
主要仪器设备
.......................... ........................
6
1.1.5
引 物
............................................. .............
6
1.2
方法
........ .................................................. ..
7
1.2.1
病料的采集和处理
........... ...................................
7
1.2.2
病毒的增殖与纯化
........................ ......................
7
1.2.3
病毒的
RT-PCR
检测
....................... ......................
7
1.2.4
鸡胚尿 囊液的血凝活性测定
..................................... .
8
1.2.5
鸡胚尿囊液的
RT-PCR
检测.......................................
8
1.2.6
毒株半数感染量（
EID
50
） 的测定
..................................
8
2
结果与分析
..................... ..................................
1
0
2.1
病鸡剖检结果分析
.......................... .....................
1
0
2.2
病毒
RT-PCR
检测结果分析
.................... ....................
1
0
2.3
传毒 结果
............................................ ...........
11
2.4
传代鸡胚尿囊液的血凝检测结果分 析
...............................
11
2.5
传代鸡胚尿囊液的
RT- PCR
检测结果
................................
11
2.6 EID
50
检测结果分析
..............................................
11
2.6.1
鸡胚胚病变情况
.............. .................................
11
2.6.2 EID
50
的计算结果
..............................................
1
2
3
讨论
................... ..........................................
1
2
致谢
......................... ......................................
1
4
参考文献
....................... ....................................
1
5
1
鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
动物医学专业
指导老师
摘要：
2011
年
4
月
17
日，山东省临沂某大型养鸡厂送检一批疑似感染传染性支气管炎病
毒的 病（死）鸡，调查得知该鸡群临床上表现咳嗽、甩鼻，食欲不振，精神不佳，脱水，排
白色稀粪，爪干、 消瘦等症状且死亡率高，现进行病鸡剖检，病变表现为气管出血，
“花斑
肾”
。采集相 关病料研磨并反复冻融后，进行
RT-PCR
检测结果发现
IBV
阳性，初步 诊断该
鸡群发生了鸡传染性支气管炎。将病料接种
10
日龄
SPF
鸡 胚进行盲传，收集各代尿囊液进
行血凝试验、
RT- PCR
检测，同时观察对鸡胚的致病变特征，结果发现血凝试验均呈阴性，
RT-PCR
结果
IBV
表现阳性，新城疫（
NDV
）
、禽流感（
AI V
）等其他外源病毒阴性，鸡胚
表现蜷缩、生长阻滞现象，符合
IBV
的生物 学特征，表示成功分离到了
1
株鸡传染性支气
管炎病毒。
关键词：
传染性支气管炎病毒；分离鉴定；
RT-PCR
2
Infectious Bronchitis Virus
Isolation and Identification
Veterinary Medicine
Tutor
April 17, 2011, a number of patients (dead) chickens infected with suspecting infectious
Abstract
：
bronchitis viruse from a large chicken farm for inspection in Linyi, Shandong Province,survey that
the clinical manifestations had cough, thrown nose, loss of appetite, of sorts, dehydration, row of
white Xifen, claw dry, weight loss and other symptoms ,and high mortality, now dissect chickens,
the
lesions
showed
tracheal
bleeding,
kidney
disease,
repeated
freezing
and
thawing
material
after
grinding,
the
RT-PCR
test
was
found
positive
for
IBV,
the
initial
diagnosis
of
the
avian
infectious
bronchitis
in
chickens
was
sure
preliminarily
.
The
epidemic materials was inoculated to the 10-day-old SPF chick embryo to
blind transfer, allantoic
fluid
collected
for
the
generation
of
hemagglutination
test,
RT-PCR
test,
and
observed
the
characteristics of the embryo-induced lesions,finding that hemagglutination test were negative, the
RT
–
PCR
of
IBV
results
showed
positive
for
Newcastle
disease
(NDV), avian
influenza
(AIV)
and
other
exogenous
virus-negative,
chick
embryo
displayed
the
phenomenon
of
curling
and
growing retardation, in line with the biological characteristics of IBV, it was successful to isolate
an avian infectious bronchitis virus .
Key words:
IBV ,Separated and identified ,RT-PCR
3
引言
鸡传染性支气管炎（
Infectious
Br onchitis
，
IB
）是由鸡传染性支气管炎病毒
引起的一种急性、高度接触性的传染病，
其特征主要为病鸡出现呼吸道症状、
产
蛋数量和品质下降以 及肾脏病变等。
鸡传染性支气管炎可以造成非常严重的经济
损失，其主要包括：饲料报酬的下降 ，增重的减少，同时并发感染引起气囊炎，
使肉鸡在加工的过程中被淘汰，
且产蛋下降和蛋品质 下降等。
虽然疫苗的使用对
鸡传染性支气管炎的流行起到了一定的预防和控制作用，但由于IBV
属于冠状
病毒科（
Coronaviridae
）冠状病毒属（
Coronavirus
）的代表种，为外被囊膜的单
股正链
RNA
病毒，其突出的特点是血清型众多，且不同的血清型之间缺乏交叉
保护性，
并不断出现新的变 异株，
这一特点使鸡传染性支气管炎在免疫鸡群和非
免疫鸡群发生和传播，
给养禽业造 成了重大的经济损失。
鉴于此，
各国学者对
IBV
的分子生物学研究越来越重 视。
鸡传染性支气管炎最初于
1930
年发现于美国
North Dakota
，
1931
年由
schalk
和
Hawn首次报道
【
1
】
，
Jungherr
【
2】
等于
1956
年证实
IBV
抗原的多样性及其在传
染 性支气管炎流行病学中的重要性，之后很多国家和地区对该病都有报道
【
3-5
】。
1956
年
Bijlenga
第一次确诊
IB
在荷兰 存在。自
1978
年起，荷兰开始出现新血
清型的
IBV
和变异株；
1962
年，
Cumming
在澳大利亚分离出一株肾致病性毒株。
1980
年到
1990
年分离的
IBV
是呼吸型毒株，主要引起病鸡 的呼吸道症状。自
1987
起，
IB
主要以呼吸型为主，而且病毒的组织嗜性 发生变化，由嗜肾型转变
为嗜呼吸道型；
1986
年，
El-Ho uadfi
【
6
】
等在摩洛哥首次分离出嗜肠型
IBV
毒株 ，
主要引起呼吸道、肾脏及肠炎病变等症状。此后，
1991
年，英国发现一株引起< br>高死亡率的特殊
IBV
毒株。日本最早于
1954
年分离到
I BV
，此后不断有
IB
的
发生
【
7-9
】
。
1980
年以前的
IBV
分离株主要引起呼吸道症状和蛋鸡产蛋量下降，< br>1980
年以后的
IBV
分离株以肾致病性毒株为主，引起肾脏病变。
1986
年韩国首次有关于
IB
发生的报道，
其产蛋鸡表现为呼吸困 难，
产蛋量及
蛋的品质下降，
但通过通过免疫接种则很容易控制疾病的爆发。
从
1990
年起产蛋
鸡群和肉鸡群开始爆发肾致病型
IB
。
我国于
1953
年有呼吸型
IB
发生的报道。
我国首次IB
存在的报道是邝荣禄在广
东于
1972
年确诊出，肾型
IB
的发生是辛朝安于
1982
年在广东首次报道
【
10
】，
之
后，李康然与
1990
年在广西分离出一株肾致病性IBV
【
11
】
。随之，国内相继有
20
多个省市区出 现关于肾型
IB
发生的报道。
1995
年杜元钊在中国胶东地区分离出嗜
4
输卵管和卵巢型
IBV
变异株。
1995年以来，我国江苏、山东等地出现
IBV
变异株，
其特征主要为生长阻滞、消瘦、 腹泻，剖检表现为腺胃肿大、腺胃壁增厚、腺胃
粘膜出血溃疡、腺胃乳头平整、融合等。
200 4
年，刘胜旺等报道我国免疫鸡群和
非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性
IBV
在流行。
2005
年杨杰华等报道于
2002
年
从山东分离了一株
IBV
变异株。
1964
年台湾首次分离出第一株，此后不断有
IB V
发生的报道。
IB
在临床上可分为呼吸型、
肾型、
肠型 等多种病型，
还有一些变异的中间型。
IBV
可使不同日龄、
品种和性别的鸡 均易感染，
IBV
感染的症状与感染的毒株、
日
龄及并发症的存在性等因素有 关。
1
～
4
周龄鸡感染后的主要症状表现为精神不
振、呼吸困难等， 并随病情的发展而出现死亡，其中幼鸡死亡率约
25
％，雏鸡死
亡率高达
75
％～
90
％。肾型
IBV
感染鸡时，其患病初期的症状主要表现为咳 嗽和
甩鼻，精神沉郁、羽毛松散
【
12
】
。大多数病鸡食欲下降，饮 欲增强，鸡冠发绀，
闭目嗜睡，两翅下垂，拉绿色或白色的稀粪，同时可见含尿酸盐的白色的粪便，并有时涂满肛门附近。少数鸡有呼吸啰音，但饮食无明显变化，部分鸡耐过后，
出现严重的营养不良 、
体型明显的偏小。
开产蛋鸡群除有呼吸道症状，
产蛋量和
蛋的品质也随之下 降，具体表现为产蛋鸡发病
2
～
3 d
后，产蛋下降
20
％ ～
40
％，
治愈后产蛋水平大多不能恢复到产蛋以前的水平，
出现软壳蛋、< br>畸形蛋等但一般
死亡率很低。
加强
IBV
的研究，对鸡疾病 的防治有重大意义。本研究通过病鸡剖检、
RT-PCR
检测、组织研磨液鸡胚盲传、血凝试验 等来分离鉴定山东省临沂某养鸡
场的疑似传染性支气管炎毒株。
1
材料与方法
1.1
材料
1.1.1
病料
疑似鸡传染性支气管炎的病（死）鸡，来自山东省临沂某大型养鸡场。
1.1.2
鸡胚、鸡红细胞
实验用
10
日龄SPF
鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，本实验室孵化。
1%
鸡血红细胞悬液 由本实验室制备。
即取
SPF
鸡新鲜抗凝血
10ml
，
用灭 菌
0.01M
PBS
缓冲液洗涤
3
次，每次以
2000r pm
，
4
℃离心
5min
；将沉积的红细胞用灭菌
0.01 M
PBS
缓冲液配成
1%
悬液，立即使用或贮存于
4
℃冰 箱，供病毒血凝活性分
5
析。
1.1.3
主要试剂
M-MLV
反转录酶、
RNA
酶抑制剂、
Taq
DNA
聚合酶
蛋白裂解液、
dNTP
、
DNA
Marker
购自大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、氯仿、琼脂糖、购自天津化学试剂三< br>厂；异丙醇购自上海埃彼化学试剂有限公司。
1.1.4
主要仪器设备
PCR
基因扩增仪
（杭州朗基科学仪器有限公司）< br>，
DYY-1118
型稳压稳流电泳仪
（北京六一仪器厂）
，高压锅（
LABAUTOCLAVE
S/N
ZY0302
，
SANYO< br>）
，
DYY-11131A
型电泳槽，三孔电热恒温水槽（
DK-8D
型，上海一恒科技有限公司）
,
电热恒温
培养箱（
HENGZI< br>，上海跃进医疗器械厂）
，微型漩涡混合仪（
XW-80A
型，上海沪
西分析仪器厂）
，台式高速冷冻离心机（
TLL-C
型，北京四环科学仪器厂）
，超净
工作台
（苏州仪器四厂）
，
紫外分光光度计
（
S5 1/52
型，
上海棱光技术有限公司）
；
1.1.5
引物
参照
GenBank
发表的
IBV
全基因 核苷酸序列中的全基因序列设计的
1
对特
异性引物（
B1
、
B2
）用于传支阳性病料的检测。引物由大连宝生物工程有限公司
合成。引物为
N基因的一段保守序列，见表
1
。
表
1
引物
Table1 The sequence of primers in the research
名称
B1
上游
B2
下游
序列
5' AGATGTTGGGGAAGTCACTG 3'
5' GATTTGGACCTTATCCATACG 3'
1.2
方法
1.2.1
病料的采集和处理
对病鸡进行剖检，观察，取病死鸡的肺、气 管、肾脏等组织，剪碎，将病料
按
1
：
4
加
PBS
缓冲液研磨成乳状，
-70
℃冰箱反复冻融
3
次后
5000rpm
离心
10min
，取上清于无菌离心管中，加青、链霉素
4
℃作用< br>3h
，然后置
-70
℃保存备
用。
1.2. 2
病毒的增殖与纯化
将用抗生素处理过的病料上清液通过尿囊腔接种
10日龄
SPF
鸡胚，每枚鸡
胚接种
0.2ml
上清液，
接 种
3
枚鸡胚，
标明
①
,
②
,
③
；
于电热恒温培养箱中
37
℃
培养
36h
，每天照胚
2
次，检查鸡胚活性，弃去
24h
内死亡的鸡胚；连续盲传
5
6
代并无菌收集尿囊液。
1.2.3
病毒的
RT-PCR
检测
1.2.3.1
病毒
RNA
的提取：
（
1
）取
1.5m l
离心管内加
750ul
裂解液，
400ul
病料上清，编号，颠倒 均
匀，室温静置
5min
。加入氯仿
150ul
，颠倒混匀，室温静 置
5min, 12000r
离心
15min
。
（
2
）
取上清
700ul
，
加异丙醇
700ul
，
编号，
颠倒混匀，
室温静置
10min,12000r
离心
10min,
倾倒上清，沿离心管壁加入冷乙醇（
75
％）
1000ul，冲洗
1
次，最
后低速离心，吸去残液。
1.2.3.2
病毒
cDNA
的获取
:
配
20ul
反转录体系（ 试剂比例见表
3
）
，震荡低速离心，溶解核酸，低速离
心，放入
42
℃水浴锅内反转录
1h
。
表
2
反转录体系
Table2 the system of reverse transcription in the research
试剂或样品
注射用水
5
×
Buffer
dNTP(10mmol/L)
反转录酶
M-MLV
RNA
酶抑制剂
(Inhibitor)
引物
B1+B2
剂量
11ul
4ul
2ul
1ul
0.5ul
0.75ul+0.75ul
1.2.3.3
基因的
RT-PCR
扩增
:
配
30ulPCR
体 系
(
试剂比例见表
4
）
，
将
28
ul< br>体系加入
eppendorf
管
（
200ul
）
，< br>加反转录产物
2ul
吹打。编号低速离心，放入
PCR
仪进行扩增。 程序为
95
℃预
变性
3min
，然后按以下参数（变性：
9 5
℃
1min
；退火：
55
℃
1
min
；延伸：
72
℃
2 min
）进行
30个循环，循环结束后
72
℃延伸
10min
。
7
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
怀孕hcg正常值对照表-
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