梅毒症状女血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图特征

2021年1月18日发(作者：瞿同祖)
北京协和医院检验科

张时民






血细胞分析技术已经进入自动化时代，
而具有白细胞五分类或更多分析参数的仪器也 普
遍的应用于国内各级医院实验室中，为临床诊断和治疗服务。而具有
18
项参数带有 白细胞
三分群功能的血细胞分析仪也已经普及进入到基层医院和社区医疗中心，
在许多大型医院 中
已不占主流位置，
因此可以说目前在较大医院的检验科，
常规血细胞分析仪已经进入 全自动
化和白细胞五分类的时代。







本文主要介绍全自动血细胞分析仪在白细胞五分类上的原理和散点图分布特点。
此类 仪
器在红细胞、
血红蛋白、
血小板和计算参数上一般会采用类似的测定原理和计算方法 ，
此类
仪器的进展和其功能特点可参考作者撰写的其它文章（见参考文献）
。具有白细 胞五分类功
能的血细胞分析仪器是指通过各种物理和化学技术对白细胞进行分析，
以获得外周血 液中白
细胞的五种常见类型，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，
淋巴细胞和单核细 胞
的百分率和绝对值的测定结果，此外还应该具有对出现异常白细胞的提示或初步分类功能。


目前国内外具有开发研制白细胞五分类法仪器的主要为欧美和日本生产厂商，
比较著 名的欧
美厂家有
Beckman-Coulter
；
ABBOTT
；
Siemens
（
Bayer
）
；
ABX
；日本有
Sysmex
和
Nihon
Kohdon
。在国内已经有迈瑞（< br>MINDRAY
）
公司生产几个型号的五分类血细胞分析仪器投入
医疗市场。< br>


一

简要发展史



1974
年，一种名为
HEMALOG D
的具有初步白细胞分类功能的白细胞分析仪问世。


1982
年 ，
Technicon
公司生产了
H6000
型血液细胞分析仪器，
应该是首款具有白细胞五分类
能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪
HITACHI 8200
型，
仅仅
是用于完成白细胞血片分类的仪器，没有其他血细 胞计数分析能力。



Technicon
公司
1985
年开发了比较成熟的具有白细胞五分类功能的
Technicon H1
型血液细
胞分析仪，随后升级为
H2
型和
H3
型。



COULTER
公司在
1987
年开发研制其经典< br>VCS
技术，
并推出持续具有多年影响力的、
具有
白细胞五分类功能的 血液细胞分析仪
MAXM
型。



1990
年 前后，欧洲和日本许多厂家都陆续推出了各种类型的具有白细胞五分类功能的血细
胞分析仪器。各厂家设 计生产的此类血细胞分析仪，其在白细胞分类技术上原理各不相同，
分析测定项目略有不同，
且 形式多样，结构复杂，
试剂种类和成分也趋于复杂。不断改进和
升级的新产品使得仪器在白细胞 分类技术上更加成熟和可靠。
而技术的提高也带来了仪器和
消耗品（试剂）价格的增加。



二

仪器原理和散点图特点



1
体积、电导和激光散射原理







这是
Beckman
－
Coulter
公司生 产的血细胞分析仪所采用的经典分析方法，他集三种物
理学检测技术于一体，
在细胞处于自然原 始的状态下对其进行多参数分析。
该方法也称为体
积、
电导、
激光散射血细胞 分析法。
此技术采用在标本中首先加入红细胞溶血剂溶解掉红细
胞，
然后加入稳定剂来 中和红细胞溶解剂的作用，
使白细胞表面、
胞浆和细胞体积保持稳定
不变。然后应用鞘 流技术将细胞推进到流动细胞计数池（
Flowcell
）中，接受仪器
VCS
三种
技术的检测。






V
代表体积（
V
olume
）测量法，是采用经典的库尔特专利技术，用 低频电流准确分析
细胞体积。
体积是区分白细胞亚群的一个重要的参数，
它可有效区分 体积大小差异显著的淋
巴细胞和单核细胞。
C
代表高频电导性（
Conduc tivity
）
，采用高频电磁探针原理测量细胞内
部结构间的差异，
也是该 公司的专利技术。
细胞膜对高频电流具有传导性，
当电流通过细胞
时，
细胞核 的化学组份可使电流的传导性产生变化，
其变化量可以反映出细胞内含物的信息。
该参数可用来 区分体积相近而内部性质不同的细胞群体，
如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，
由于
它们的细 胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。
S
代表激光散射（
Scatter
）测量技术，
采用氦氖激光源发出的单色激光扫描每个细胞，收集细胞在
10°
～70°
角度内出现的散射光

(MALS)
信号。该激光束可穿透细胞， 探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，提供有
关细胞颗粒性的信息，
可以区分出颗粒特性 不同的细胞群体。
例如细胞内颗粒粗的要比颗粒
细的散射光更强，因此可以用于区分粒细胞中的 嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞。




图
1 VCS
法的测定原理







仪器将分析每个细胞在
V
、
C
、
S
三种检测技术 上的测量结果，因为不同类别的细胞会
在体积、表面特征、内部结构等方面呈现明显的不同。将这些特征 性信息被定义到以
VCS
为三维坐标
(
分辨率为
256×
2 56×
256=16,777,216)
所形成的立体散点图中，这五类细胞可在三
维 空间中形成特定的细胞群。
通过计算某群细胞数量占白细胞总数的百分比，
即可得到五项
白细胞分类结果。
仪器不仅仅做出对正常白细胞的五项分类结果，
给出典型的散点图型，还
可以提示许多异常细胞区域的报警。






VCS
技术可通过
DF1
、
DF2
、
D F3
三个散点图
将五种类型白细胞明显区分开。
三个散点图的纵坐标均定义为细胞体积 。
DF1
为细胞体积和
激光散射的直方图，
DF2
和
DF3
为细胞体积和高频电导性的直方图，
DF3
为除去粒细胞群
体后显示出淋巴细 胞后面的嗜碱性粒细胞图像。



图
2
各类白细胞在
VCS
三维空间中的分布特点





图
3
各类白细胞在散点图中的分布特点







VCS
技术是
Beckman
－
Coulter
公司开发研制的经典专有方法，到目前为止的各种高档
血细胞分析仪均 采用该方法对白细胞进行分析。
该方法在白细胞分析上尚有特殊能力，
例如
可以测定和 分析中性粒细胞的体积、
核浆比例、
细胞颗粒特性等参数，
也就是将中性粒细胞
的
VCS
三个参数分别给出，用于了解细菌感性疾病与其它疾病的区别。也可对淋巴细胞、< br>单核细胞等均作出其细胞群体的三个技术参数值，是比较有前景的研究内容。







仪器在
RBC
、
PL T
、
WBC
计数上依然采用电阻抗法，血红蛋白仍然采用比色法测定。
该公司 的五分类法血细胞分析仪先后推出多种类型，如
MAXM
、
STKS
、
GEN·
S
、
HmX
、
LH755
和最新的
LH 780
等型号，在某些机型还具有网织红细胞分析功能和
T
淋巴细胞亚群
分析 功能。



2.
电阻抗、射频和细胞化学技术







日本
Sysmex
公司系列血细胞分析仪是在国内应用非常广泛的仪器，
从三分类法到五分
类法的各种型号仪器都 有大量用户。
其仪器型号种类丰富，
功能和测定参数各异，
其各种仪
器间均有 近似的检测原理，
但在结合特定的功能以达到不同的分析目的方面，
其原理和所用
试剂 又有不完全相同之处。本文以目前其最高配置的
XE-2100
型血细胞分析仪为例说明其在白细胞计数和分类方面的原理和特点。







Sysmex
XE-2100
在白细胞分类上采用半导体激光流式细胞技 术结合核酸荧光染色技术
进行白细胞计数和分类。
半导体激光照射在通过鞘流技术处理的细胞上 ，
可根据每个细胞所
产生的三种信号来鉴别细胞类别。前向散射光（
FSC
） 信号可反应细胞体积大小；侧向散射
光（
SSC
）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内 含物的信息；侧向荧光（
SFL
）强度信号则
用于分析细胞内脱氧核糖核酸（
DNA
）和核糖核酸（
RNA
）的含量。







在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类，
两个 通道均采用激光和鞘流进
样的方式测定。
DIFF
通道：

STRO MATOL
YSER-4DL
试剂中的表面活性剂可以溶解掉标本
中的红细胞和血小板 ，
并在白细胞膜上打出小孔；
然后第二种试剂

STROMA
TOL
YSER-4DS
中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，
与细胞核的核酸和细 胞器结合，
在经过波长
633nm
的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正 比。
STROMATOL
YSER
-4DL
试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性 结合的能力，
可根据侧向散射光信号强度，
将嗜酸性粒细胞
从中性粒细胞中分离出来。 这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞清
楚的分离开。在
DIFF
散射图当中可以得到白细胞的四个分群（
LMNE
）
。







WBC/BASO
通道是专用作检测嗜 碱性粒细胞的通道，因为嗜碱性粒细胞数量非常少，
因此必须采用特殊技术处理。
STROMA TOL
YSER
–
FB
是一种酸性试剂，可将红细胞和血小
板形成 淡影化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态，然后采用前向散射光
（
FSC
）信号和侧向散射光（
SSC
）信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来。前向散射
光与细胞体积测定相关，
侧向散射光与裸核后的细胞结构复杂性有关。
在这个通道中可以获< br>得白细胞总数和嗜碱性粒细胞的数量。



图
4 Sysmex XE-2100
白细胞分类散点图












仪器在幼稚粒细胞分析上 有特殊的
IMI
通道，在
IMI
检测通道中主要应用射频（
RF）
技术和直流电阻抗法
（
DC
）
。
这个测定通道根据幼 稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质
少的现象，在稀释液中加入硫化氨基酸（
IM
试剂）
，由于占位不同，结合在幼稚细胞表面的
氨基酸较多，
对溶血剂有抵抗作用，< br>对幼稚细胞具有保护作用。
当加入溶血剂后成熟细胞易
被溶解掉，
而幼稚细胞不 易被溶解破坏，
可通过电阻法检测出来。
射频技术用于测量细胞核
的大小和颗粒的多少 ，而直流电信号可反应出细胞体积的大小。







在有核红细胞计数上通过专门的有核红细胞检测程序和专用通道
-NRBC
通道，在处理
标本时加入
STROMATOLYSER
－
NR
专用试 剂，它能使成熟红细胞溶解又可保持有核红细
胞的核结构，同时也将白细胞保持完好。
STRO MA
TOL
YSER
－
NR
试剂中的聚次甲基荧光
染料可渗 透进入白细胞膜内，
将白细胞和有核红细胞的核染色。
通过检测荧光强度得到：
白细胞核大荧光强度高，有核红细胞核小，
荧光强度低，正常红细胞无细胞核和破碎，荧光强
度极低。
根据荧光强度差和前向散射光信号测定的细胞体积差，
可将有核红细胞从其他细胞群中区分出来。



图
5 Sysmex XE-2100
的幼稚细胞通道和有核红细胞通道散点图







该仪器在红细胞和血小板的计数和分析上仍然沿用了经典的电阻抗方法，
在血红蛋白测
定上采用了无剧毒物质的
SLS
溶血剂比色法。



3
激光散射和细胞化学染色技术







最早采用该技术的是
Technicon
公司的H1,H3
型，现在的最新型为西门子公司的
Advia120
型和
21 20
型（
2007
年以前为
Bayer
公司产品）
。他是一 款开发比较早的高等级仪
器，
其在白细胞分类上采用了过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道 。
根据细胞化学染色
的特性进行白细胞分类。
在红细胞和血小板分析都采用了双角度激 光法。
在仪器的管路、
电
磁阀门、
反应杯上采用了独特设计的集成液流版管路 系统，
是目前血细胞分析仪中所独有和
特有的技术。







集成液流板实际上是将各种管路和电磁阀门、
反应杯等血球计 数仪的常用硬件进行综合
处理，系统化，微小化，透明化和集成化。形成的集成板被放置在仪器的明显部 位，方便观
察，
并具一定的美观效果。
其另一特点则是细小的管路和反应杯可是标本和 试剂用量明显减
少。



图
6 Advia 120
的集成液流板。



在白细胞分类上，
该仪器采用 两个通道进行，
一个为过氧化酶检测通道，
另一个为嗜碱细胞
检测通道。







过氧化酶反应（
perox idase
，
POX
）是血涂片染色的一个常用细胞化学染色方法，用于
鉴别 原始细胞与成熟的粒细胞，
鉴别粒细胞与非粒细胞。
染色后的细胞内无蓝黑色颗粒出现
为阴性反应，
出现细小颗粒或稀疏样分布的黑色颗粒为弱阳性反应，
出现黑色粗大而密集的颗粒为强阳性反应。
过氧化物酶主要存在于粒细胞系和单核细胞系中，
各类白细胞对过氧化
物酶的反应是这样的：早期的原始粒细胞为阴性，早幼粒以后的各阶段都含有过氧化物酶，
并随 着细胞的成熟过氧化酶含量逐渐增强，
中性分叶核粒细胞会出现强阳性反应，
嗜酸性粒
细胞具有最强的过氧化物酶反应，
嗜碱粒细胞不含此酶呈阴性反应。
在单核细胞系统，
除早
期原始阶段外，
幼稚单核和单核细胞会出现较弱的过氧化物酶反应。
淋巴细胞、< br>幼稚红细胞、
巨核细胞等都为过氧化物酶阴性反应。
Advia
120/21 20
血细胞分析仪的过氧化酶（
Perox
）
检测通道就是根据这个原理设计 的，
它检测每一个通过流动计数池中的白细胞，
经过激光照
射所产生的过氧化酶散射光 吸收率，来当然试剂和辅助试剂均进行了改良。







在
Perox
通道所产生的散点图，
横轴表示在
5
°
-15
°激光散射获得的细胞过氧化物酶含
量情况，纵轴是低角度散射光测量的细 胞体积大小。在此通道内细胞被分为五类。
1
）过氧
化酶最强阳性的嗜酸性粒细胞；< br>2
）过氧化酶强阳性的嗜中性分叶核粒细胞；
3
）体积较大、
过氧化酶 弱阳性的单核细胞；
4
）体积较小、过氧化物酶阴性的淋巴细胞；
5)
体积大 于淋巴
细胞且过氧化物酶阴性的未染色大细胞，此类细胞增加提示幼稚或原始的各类细胞可能出
现。







在嗜碱细胞（
Baso
）通道中采用的检测原理是：专用的嗜碱细胞试剂（
Baso
）将除了嗜< br>碱细胞以外的白细胞除去细胞膜，
使其裸核化并体积变小，
仅将嗜碱性粒细胞保持原有状 态，
体积明显大于其他类的白细胞。
在散点图上处于上面区域的为嗜碱性粒细胞；
散点 图的横坐
标可表示细胞核结构的复杂性，处于左侧的为单个核的细胞群，包括单核细胞和淋巴细胞；处于右侧的为分叶核细胞；中间部位则考虑为杆状核细胞；左下端为单个核的原始细胞区。



图
7
：
ADVIA 120/2120
仪器< br>Perox
通道和
Baso
通道散点图







该仪器在红细胞、
血小板的测定上也采用了光学检 测技术。
通过激光照射扫描每个通过
Flowcell
的红细胞，低角度散射光（2
°
~3
°）用于测量细胞体积；高角度
(5
°～
15
°
)
散
射光测量每个红细胞内的血红蛋白浓度（
CH
） 和血红蛋白含量平均值
CHCM
。这两个值不
受红细胞数量和血红蛋白测定的影响。< br>还可根据每个红细胞内血红蛋白浓度，
计算出红细胞
内血红蛋白分布宽度（
HD W
）值。其根据红细胞在体积大小和单个红细胞内血红蛋白含量
的分析，
将红细胞划分 为
9
个区域，
得到红细胞体积和色素含量分布的九分图，
也是该仪器
在红细胞分析方面独有的特色，根据红细胞分布情况可初步判断疾病类别（下图中）
。在血
小板 计数分析上也同样采用了二维光散射分析法，
即可获得血小板体积大小，
可测量
1~6 0fl
内的各种大小不同的血小板，还可对血小板内容物含量（
MPC
）进行测定。血 红蛋白测定
采用连续流动比色法和红细胞散射光直接测定法两种方法，
有助于高脂血和高胆红素 血标本
的血红蛋白测定准确性。




图
8
：
ADVIA 120/2120
红细胞散点图（左）和血小板散点图（右）



4
双鞘流技术和细胞化学染色法







ABX
是法国生成血细胞分析仪器的著名厂家，
其生产的全自动血细胞分析 仪
Pentra 120
型为其高端产品。在白细胞分类上采用该公司特有的专利技术
-
双鞘流（
DHSS
）分析法。双
鞘流是专利技术，
而测定本身是通 过电阻抗和光吸收法双重原理。
标本首先在第一鞘流液中
经过电阻抗测定分析，得到细胞体积测 定结果，然后通过第二鞘流引导再行光吸收率分析，
对细胞内容物进行测定，
最终将细胞测定信 息在散射图相应的位置表现出来。
双鞘流技术的
核心部件是含有红宝石小孔的复杂的鞘流池，在 双鞘流系统的上下两端分别加上恒定电流，
是保证电阻法的测量要素。
为了保证被检测的细胞能 够正确通过计数孔和鞘流通道，
需要利
用外来鞘流来进行矫正，
因此通过左侧鞘流泵注 入稀释液形成第一鞘流液，
其作用是保护溶
液能够直接通过计数小孔，
并且保证其中携 带的细胞处于中心部位，
液流不发生偏移和扭曲；
溶液通过计数小孔后，
再通过中间鞘 流泵注入稀释液形成第二股鞘流，
用以保证吸光度测量。
这样的过程被称为双鞘流分析技术。< br>