白醋洗脸一周几次最好RNA提取电泳注意事项

2021年1月18日发(作者：林里)


心之所向，所向披靡

imingxian
提取
RNA
及用
DEPC
去除
RNase
的个人总结


快速的操作，低温环境，少量取上清

主要是抽提之后吸取上清时要特别小 心，只要不把蛋白层吸出来就不会有
RNase
污染。

分子克隆第二版343
页
,
上关于提取
RNA
所用的玻璃容器的处理方法
,
是用前
180
度干烤
8
小时或更长时间
;
另一 种方法是
0.1%
的
depc
水浸泡
(37
度
< br>2
小时
),
然后灭菌水淋洗数次
,100
度干烤
15
分钟
,
然后高压灭菌除去
depc.
我们实验室一
直是用< br>170
度考
4
小时
,
且不准离人
,
不准过夜
,
可能是怕烤箱长时间高温
,
线路老
化会发生危险吧


提取
RNA
所用的枪头，
EP
管。直接高压烘干即可。如 果用
0.1
％
DEPC
处理，
要在
DEPC
配置后 振摇
1
小时后再浸泡枪头，
EP
管方有效。我做的都是将枪头
泡在配 制好的
depc
中，摇振过夜，然后倒掉
depc
注意要到干净，再高压，为
了防止仍残留液体可
120
度干烤一会

A.
对于提取RNA
来说
,
我认为关键的一点在于实验器材的准备
.
包括从最 初的标
本的制备
,
保存
,
以及之后的试剂的准备
,
匀浆器
,
镊子
,tip
头的去除
RNase
处理
,
尤
其是去除
RNase
的
DEPC
处理步骤

B.
您在处死大鼠前
,
先准备好干净的冻存管
(
用
1.5ml
的
Ep
管也可以
,
就是后面您
在从液氮中取出 的时候容易爆
,
您的注意安全
),
然后将去除的骨骼肌立即用干净
的 剪刀分成半颗到一颗黄豆大小
,
装入冻存管后立即投入液氮保存
.
个人认为在 这
里使用装标本的管子没必要用
DEPC
处理

C.
在提取
RNA
之前
,
将试剂
(TRIzol)
和器械
(t ip
头
,
镊子
,
匀浆器
)
都准备好
D.
从液氮取出标本后
,
立即转移进入事先加入
TRIzol
的 匀浆器内
(
最好置冰上操
作
),
立即匀浆
,
一直到 标本完全碾磨碎
,
这个时候
TRIzol
液体成浑浊状
,
而 且匀浆器
的壁上没有太多的黏附组织
,
然后将
TRIzol
转出,
继续后续的步骤
.
1 Rnase
是一种蛋白酶，能够降解
RNA
。

2
我们的手 上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被
RNA
病毒感染？或者什么的。< br>
3
这个酶高效稳定。要么在
DEPC
水中处理
n
小时，要么在
160
度高温烘烤
6
小时。此酶才会失效。

4
所谓
DEPC
，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓
DEPC
水，一
般指两种状态，
a
，配制

好未消毒；b
，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质
会降解，从而无毒。

1 < br>无菌蒸馏水中加入
0.1%(v/v)
焦碳酸二乙酯（
DEPC
），室 温搅拌
4
小时以上
至完全溶解，高压灭菌
20
分钟，冷却备用。这个 是
DEPC
水的
b
状态。

2
如果你要用
DEPC
水处理
Tips
等等东东，那么就要用高压前的水，即
DEPC< br>水的
a
状态。把枪头管子等完全浸泡至少
8
小时，我一般都是过夜的， 或者平
时就泡在里面备用。

RNA
提取必须创造无
RNase< br>的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处
理

：研钵、研棒、药匙、玻璃 器皿等需在
180
℃烘干
4h
以上；电泳槽、胶板、
梳子、用
0.1 %
～
0.2%DEPC
水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用
0. 5%
的




SDS (Sodium dodecyl sulfate
，
抑制
RNase
的活性
)
浸泡过夜
，
然后用
ddH2O
冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用
0 .1%
～
0.2%DEPC
水处理
之后
(DEPC
有致癌之 嫌，须小心操作
)
。
3
7
℃保温
12h
以上，然后 高压灭菌，灭
活
DEPC ( Diethypyrocarbonate )
；
溶液都需用经
DEPC
处理过的水配置
，

RNA
提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。


我们研究 所里提
RNA
用的枪头和
EP
管都是高压两遍的
，
没有用< br>DEPC
水处理
。

1
、

有灭菌过的< br>DEPC
水，这一般是用来配
75%
乙醇用，因为乙醇若高压灭菌
会挥 发，所以乙醇是新开封专用的。

2
、

没有经高压灭菌的
DEPC
水
，
这主要是用于配你提
RNA
所用的其他试剂
（所
说的试剂是可以经高压灭菌的）
，总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去
除
DEPC
，以防止它以随后实验的干扰。

3
、
DEP C
处理水：无菌蒸馏水中加入
0.1%(v/v)
焦碳酸二乙酯（
DEPC< br>），室
温搅拌
4
小时以上，
121
度高压灭菌
20
分钟，冷却备用。


凡是不能用高温烘烤 的材料如塑料容器等皆可用
0.1%
的焦碳酸二乙酯
(DEPC)
水溶液处理
,
再用蒸馏水冲净
。
DEPC
是
RNA
酶的化学修 饰剂
,
它和
RNA
酶的活
性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性
。
DEPC
与氨水溶液混合会产生致癌物
,
因而使用时需小心
。
试验所用试剂也可用
DEPC
处理
,
加入
DEPC至

0.1%
浓度
,
然后剧烈振荡
10
分钟< br>,
再煮沸
15
分钟或高压灭菌以消除残存的
DEPC,
否则< br>DEPC
也能和腺嘌呤作用而破坏
mRNA
活性
。
但
DEPC
能与胺和巯基反应
,
因而
含
Tris
和
D TT
的试剂不能用
DEPC
处理
。
Tris
溶液可用
DEPC
处理的水配制然
后高压灭菌
。
配制的溶液如不能高压灭菌
,
可用

DEPC
处理水配制
,
并尽可能用未
曾开封的试剂
.

为啥在
28s
之后还是有影影约约的片断？和模糊的
smear< br>？

这都与非变性电泳方式有关。
RNA
的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们
平时所知道的

RNA
电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变
性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言 ，完全可以替代变性电泳，所
以我们日常检测就都使用非变性电泳了。

电泳时间太长 了容易产生降解。最好是在
120V
左右。操作的时候有没有注意戴
口罩和手套，注意 ，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响
RNA
的质量。
无论你是提什么
RNA
只要是用异丙醇沉淀的，都得用
75
％的酒精洗涤一次。

1
样品不要太多，抽提务必充分，室温放置
5min
；

2 200ul
氯仿

剧烈振荡
20s
，室温放置
2
－
15min
；

3 13000g
离心

15min;
4
取上层水相
,
一般
400-450ul
就足够了，千万不要贪多！
***
5
加入
500ul
异丙醇

摇匀，室温放置
10min
；


6 12000g
离心

10min
；

7 75
％乙醇

1000ul
洗涤沉淀；

8 7500g
离心

5min
；（
12000
转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）

9
弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇，

室温干燥
3
－5min
；（时间太久沉淀不易
溶解）

10
适量
DEPC
水溶解沉淀。

电泳的上样量
1ug
，电泳
buffer
用
DEPC
处理的水配制，电泳时间不要太久，
95V
，
10
－
15min
足够了。

建议跑RNA
电泳。先用
2
％琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在




上样缓冲液中注意加入
RNA
酶抑制剂
。< br>注意观察带形
，
质量较好的
RNA
亮度。
28S:18S应为
2:1
。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带，

若
有，可能为基因组
DNA
污染。

OD
值只有< br>1.5
，可能为基因组
DNA
污染。参
考一下分子克隆
3。上面有
OD
值与污染
DNA
的关系。建议，酚氯仿抽提后，
上 清可少吸一些。提取后的
RNA
样品可用无
RNA
酶的
DNA
酶消化一下。注
意该酶的
buffer
中有一种物质在

OD26 0
有吸光度，应严格按照其
protocol
操
作，减少误差。


只要用
DEPC
处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于
RNA
的，即只
用处理过的枪头取过乙醇的）配就可以了。
DEPC
高温高压 时变成
CO2
和水，
再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太 紧容易发生瓶
子破掉的事情。
（我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身< br>不足以去除
RNA
酶，所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入
RNA
酶 污染也不
一定哦


75%
的乙醇用于提取
RNA
时最好还是现用现配
，
乙醇最好是新的且以后不要用
于其他方面，也就是留一瓶专门 用于提取
RNA
。
DEPC
一般高压灭菌
30
分钟就
可以了！

75%
乙醇：灭菌后的千分之一
DEPC
水
25ml 75ml无水乙醇
.
配好后装入高温烘
烤的玻璃瓶中（
160
干烘四小时 ），或塑料器皿的用千分之一的
DEPC
泡
12
小
时以上再灭
30
分钟，存放于低温冰箱
4
度保存
!!!