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继发性高血压核酸提取常见试剂的作用原理复习课程

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-17 05:08

周星驰的女儿是谁-幼儿动感音乐

2021年1月17日发(作者:关肇邺)


















精品资料

异硫氰酸胍

强用力的蛋白质变性剂,能迅速 溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白
由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白 质三维结构的
离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使
多数 蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团,它们
可以形成较强的氢键。在还原剂 存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而
去垢剂,如
SDS
存在的情况下,可以破 坏疏水作用。


盐酸胍、尿素

盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂, 它并不是一种足够强的变性剂,可以允
许完整的
RNA
从富含
RNase的组织中提取出来。

4-8M
可断裂氢键,有两种可能机制:
1
变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结
合,形成变性蛋白
-
变性剂复合物,当复合物被除去 ,从而引起
N-D
反应平衡向
右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变 为复合物,最终导致
蛋白质完全变性;
2
盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢 键,当浓度
高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶
剂,使蛋 白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往
往是不可逆的。

高浓度尿素使蛋白质变性并抑制
Rnase
活性


十二烷基肌氨酸钠

使蛋白质解体

变性


巯基试剂

1
防止蛋白质或酶等(如辅酶
A
)分子中
SH
基团氧化成二硫键,
2
在某些酶反应过程
中维持体系的还原环境。DTT

DDTE
、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于他是生
物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。
DNA
提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于
2%



巯基乙醇

β
-
巯基乙醇的主要作用是破坏< br>RNase
蛋白质中的二硫键(
肽和蛋白质分子中的
半胱氨酸
残基中的 键
)。

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2
精品资料

1
还原蛋白质二硫键,使
Rna
酶变性

2
抑制酚类氧化, 若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物
引起磷酸二酯键的断裂及导致
RNA

DNA
的交联

3
保护蛋白质的巯基

蛋白质提取中需要


巯基乙醇还原二硫键,使
RNA
酶失活

化学变性剂
SDS
、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白
质变性但不影响肽键和二硫键,不 能使蛋白质彻底变性

加上还原剂巯基乙醇或
DTT
,能还原二硫键,使RNA
彻底变性


DTT
二硫苏糖醇

刺激 性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。而且
DTT
比巯基乙醇的浓度

7
倍时,两者效果相近,但
DTT
价格略高一些。由于容易被空气氧化,因此
DTT
的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。
由于质子化的硫 的亲核性较低,随着
pH
值的降低,
DTT
的有效还原性也随之
降低 ;
DTT
或含有
DTT
的溶液不能进行高压处理。

抑制
Rnase
活性

TCEP

(2-
甲酰乙基
)
膦盐酸盐

半胱氨酸


Trizol
苯酚、异硫氰酸胍、
8
-羟基喹啉、β
-
巯基乙醇等。
TRIzol
的主要成分是苯
酚。苯酚的主要作用是裂解细胞, 使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制
RNA
酶活性,因此
TRIzol
中还加
入了
8
-羟基喹啉、异硫 氰酸胍、β
-
巯基乙醇等来抑制内源和外源
RNase

RNA酶)。

0.1%

8
-羟基喹啉可以抑制
RNase
,与氯仿联合使用可增强抑制作用。

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3
精品资料

异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋 白
质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。

β
-巯基乙醇的主要作用是破坏
RNase
蛋白质中的二硫键。



液氮

组织破碎,裂解细胞


SDS
十二烷基硫酸钠

阴离子去垢剂,高温(
55-65
℃)裂解细胞 ,使染色体离析,蛋白变性,形成
SDS/
蛋白质
/
多糖复合物,释放核酸, 提高盐(
KAc

NaAc
)浓度并降低温度
(冰浴),使
SDS/
蛋白质
/
复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质
及多糖杂 质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的
DNA
用酚
/
氯仿抽
提,乙醇沉淀水相中的
DNA
操作简单,温和,可提取到高分子量的
DNA
,但产物多糖类杂质较多

阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶
K
和抗氧化
剂、螯合剂一起使用

可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与
DNA
分离

溶解膜类蛋白


SDS
能裂解细胞。使
细胞中的蛋白质 和核酸之间常借着静电引力或配位键结
合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使
染色体离析,蛋 白变性,释放核酸。



1

SDS
是一种阴离 子表面活性剂,能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合
到蛋白质的疏水部位
;

2

SDS
可引起蛋白质构象改变


3

SDS
是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性


4
)形成
SDS-
蛋白质复合物,并使复合物带负电

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4
精品资料


质粒方面:在
1
%的
SDS
溶液中慢慢加入
5 N

NaCl
,你会发现
SDS
在高盐浓
度下是会产生沉 淀的。因此高浓度的盐导致了
SDS
的沉淀。但如果你加入的不

NaCl< br>而是
KCl
,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠


sodium dodecylsulfate
)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾


potassium
dodecylsulfate, PDS
),而< br>PDS
是水不溶的,因此发生了沉淀。如此看来,溶液
III
加入后的沉淀实际 上是钾离子置换了
SDS
中的纳离子形成了不溶性的
PDS

而高浓 度的盐,使得沉淀更完全。大家知道
SDS
专门喜欢和蛋白质结合,平均
两个氨基酸上 结合一个
SDS
分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝
大部分蛋白质沉淀了 ,让人高兴的是大肠杆菌的基因组
DNA
也一起被共沉淀
了。基因组
DNA< br>一旦发生断裂,只要是
50

100 kb
大小的片断,就没有办法
再被
PDS
共沉淀了



CTAB
CTAB
:十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀

阳离子去污剂

一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表
面活性剂

是一种阳离子去污剂
,
低离子强度(
0.1-0.5M NaCl
),沉淀核酸与酸性多聚糖,
而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中
(> 0.7mol/L
NaCl)

CTAB
与蛋白质和多聚糖形成复合物,只 是不能沉淀核酸。通过有机溶
剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 。

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5
精品资料

CTAB
可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化 的
DNA
,这种
去污剂加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中(>
0. 7M NaCl
),经过连
续的酚
/
氯仿抽提,去除
CTAB/黏多糖
/
蛋白质复合体,异丙醇
/
无水乙醇沉淀上
清即可将< br>DNA
分离出来

CTAB
还有提高
DNA
互补链复 性速率及稳定已形成的
DNA
双螺旋的作用

CTAB
法的主要特点是用用较广

CTAB
溶液在低于< br>15
度会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料
时,必须预热,且离心温度不低 于
15




EDTA
酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性的酶

螯合
Mg2+
或< br>Mn2+
离子,抑制细胞中
DNase
的活性,该酶可降解
DNA < br>EDTA
是去垢剂,结合离子用,而它结合的部分离子是能够诱发或者促进
RNA
酶活性的,比如
Ca2+

EDTA
是一种二价离子熬合剂
,能熬合
Mg2+

Ca2+

二价阳离子
,
而 多种
RNA
酶的活性是需要依赖二价阳离子的
,
所以
EDTA
能通过
熬合二价阳离子来抑制
RNA
酶的活性

碱性条件下才能够 溶解,要和
NaOH
粉末混合后,再加水,然后用
NaOH
水溶液
调 节
pH


0.01M

DNase
酶基本失活。


BSA
酶抑制剂,使一些降解酶的活性的表面变性

精胺或其他多胺

酶抑制剂,降低核酸酶的影响

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6

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