高中生物选修一血红蛋白的提取和分离

2021年1月15日发(作者：【每个孕周的羊水标准值】孕妇羊水正常值是多少_羊水过多)
课题
3
血红蛋白的提取和分离
蛋白质是生命活动的主要承
担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于 人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细
胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质 呢？
（二）进行新课
1
．基础知识
蛋白质的物化理性质： _______ __________________________________________________ _________ ，
由此提取和分离各种蛋白质。
1
．
1
凝胶色谱法（分配色谱法）：
（
1
）原理：（图
5
－
13a
）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分 子量小的分子
穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（
2
）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（
3
）分离过程：（图
5
－
13b
）
混合物上柱→ ____________ →
___
分子流动快、
___
分子流动慢→收集
___
分子→收集
__
分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1
．
2
缓冲溶液
（
1
） 原 理：由 弱酸和 相应的 强 碱弱 酸盐组成 （如
H
2
CO
3
－
NaHCO
3
，
HC
－
NaC
，
NaH
2
PO4Na
2
HPO
4
等）， _____________________________________________ 。
（
2
）缓冲液作用： ___________________________ _____________________________ 。
1
．
3
凝胶电泳法：
（
1
）原理：不同蛋白质的 _________________________________ 不同，在电场中受到的作用力大小、
方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读教材后，填写下表：

决定运动 方
向

形成库
仑力

形成
阻力

决定运动 速
率
电荷
性质


电荷

量

分子
形状

分子

大小
（
2
）分离方法： ____________________________ 、 _______________________ 等。
（
3
）分离过程：在一定
pH
下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的 __________________
形成“蛋白质－
SDS
复合物”，使蛋白质迁移速率仅 ___________________________ 。
2
．实验设计
2.1
蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
2.2
选择实验材料
（
1
）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
（
2
）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由 和 两部分组成。
血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。
该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与
基团。
O
2
和
CO
2
结合的
2.3
从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透 析。洗涤红细胞
的目的是什么？
__________________________________ ，有利于后续步骤的分离纯化。 红细胞的洗涤过程为
血液＋ _____________ →
___
速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋
5
倍体积生理盐水 →
缓慢搅拌
10min
→ _____________ 离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无 __________ 色
思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止 ____ ；防止 ；防
止 _____________ 。
思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
加入 ___________________ ，用玻璃棒 ___________________ 一段时间。
补充： 加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。 加入甲苯的目的是溶解细胞膜， 有利于血红
蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有 细胞破碎物、脂质、甲苯有机
溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家 采取了离心分离的方法：
红细胞破碎混合液→
___
速
___
时离心（
2000cmin
×
10min
）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗 分离出血红
蛋白
2.4
如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。
_______ 。半透膜的 _________ 性，大分子物质 ____ 能通过半透膜， 离子和小分子
__
通过半透膜。 在
透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到
冲液中。
思考：为何使用
pH
＝
7
的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 总结：通过以上四个基本过
程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类 的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白
与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提 取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。
pH
＝
7
的磷酸缓
2.5
凝胶色谱分离蛋白质包括：制作 _______________ 、装填 ________ 、 __________ 和 ______
根据教材图
5
－
19
，说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞
2
个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。 色谱柱的制作过程：准备材料
→加工橡皮塞→安装色谱柱 下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材： 色谱柱的装填过程。
步骤
①
②
③
操作要求
计算称量凝胶
配制悬浮液
操作要求
色谱柱 在支架上
根据色谱柱体积计算凝胶用量
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
④

装填悬浮液
缓冲液洗涤平衡

倒入；
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡
h
⑤
样品加入和洗脱。其基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：
（
1
）红细胞的洗涤： （
2
）凝胶的预处理：
（
3
）色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
（
4
）色谱柱成功标志： ___________________________________
（三）课堂总结、点评
血
蛋白质分子的差异性
红
蛋 凝胶色谱法
白
分离过程
凝胶电泳法
的
提
缓冲溶液
成作
取
和
分
蛋白质的
样品处理 粗分离
离
提取分离

纯度鉴定
（四）实例探究
例
1
利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）
A.
相对分子质量大的
B.
溶解度高的
C.
相对分子量小的
D.
所代电荷多的
例
2
蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）
A.
样品处理、凝胶色谱操作、
SDS
－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.
样品处理、凝胶色谱操作、
理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D.
样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 ☆综合应用
例
3
用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A
路程较长，移动速度较慢
B
路程较长，移动速度较快
C
路程较短，移动速度较慢
D
路程较短，移动速度较快 （五）巩固练习
1.
凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（
纯化
C.
样品处
A.
对其他分子的亲和力
B.
溶解度
C.
所带电荷多少
D.
相对分子质量的大小
2.
凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）
A.
糖类化合物
B.
脂质
C.
蛋白质
D.
核酸
3.
选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ）
A.
血红蛋白是有色蛋白
B.
红细胞无细胞核
C.
红细胞蛋白质含量高
D.
红细胞
DNA
含量高
4.
将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）
A.
甲苯
B.
血红蛋白水溶液
C.
脂溶性物质的沉淀层
D.
其他杂质的沉淀
5.
血红蛋白因含有（ ）而呈红色
A. O
2
B. CO C. CO
2
D.
血红素
6.
下列操作正确的是（ ）
B.
红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
A.
分离红细胞时采用低速长时间离心
C.
分
D.
透析时要用
20mmoll
的磷酸缓冲液，透析
12h
）
A.
先加入
1ml
透析后的样品
B.
加样前要使缓冲液缓慢下降全
离血红蛋白溶液是低速短时间离心
7.
样品的加入和洗脱的叙述正确的是（
部流出
C.
如果红色带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功
D.
洗
脱时可以用缓冲液也可以用清水
8.
下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）
A.
样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B.
通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C.
可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D.
可通过
SDS
－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
9.
凝胶色谱法操作正确的是（ ）
A.
将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B.
将橡皮塞下部切出凹穴
C.
插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D.
将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
10.
样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）
A.
加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B.
加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C.
等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D.
用吸管小心的将
1ml
透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
★课余作业
1
、 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
2
、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意 义？