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N—糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

作者:陕西保健网
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更新日期:2021-01-12 17:20

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2021年1月12日发(作者:怀孕初期吃什么水果好)
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N—糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中
的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

作者:闵伟勇 刘丽 张舟

来源:《上海师范大学学报·自然科学版》2013年第04期

摘要:N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量
为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N- 糖酰胺酶F基因,经酶
切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将 pET28a-PNGase F 转入大肠杆菌
BL21中,16 ℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达
的N-糖酰胺酶 F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化
作用检测, 结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.
关键词:
N-糖酰胺酶 F; 可溶性表达与纯化; 中性氨基酸转运蛋白SNAT; 脱糖基化
中图分类号:Q 513+.2文献标识码:A文章编号:10005137(2013)04037206
0引言
N-糖酰胺酶F(PNGase F)主要是由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌的一种酰胺水解
酶,分子量为34.8 kDa,也存在于一些真核生物细胞内[1-2].N-糖酰胺酶F能从糖蛋白完整切
下N- 寡糖链,并将蛋白质的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸[2-4].由于N- 糖酰胺酶F切断的是天
冬酰胺残基的Cγ与Nδ的结合,因此又被称为N-乙酰-β-D- 天冬酰胺酶[5].
N-糖酰胺酶F具有广泛的底物专一性,对所有类型的N-连接 的糖蛋白都有作用[6-7].但是
天冬酰胺残基的氨基和羧基必须形成肽键的形式,并且糖链至少包含 一个N,N′-二乙酰壳二
塘核心(GlcNAcb1→4GlcNAc)[8-9].实际上,它广泛 的底物特异性是由于缺少了各种天冬酰
胺多糖的外围碳水化合物部分.N-糖酰胺酶F在糖蛋白的研究和 分析中作为一种生物化学工具
被广泛应用,包括寡糖类的研究以及糖蛋白的脱糖基化研究等[9].
脑膜炎脓杆菌的N-糖酰胺酶F基因的阅读框中含有1 062个碱基,前120个碱 基编码的氨
基酸为信号肽,因此表达的蛋白质为314个氨基酸,分子量为34.8 kDa[9].从脑膜炎脓杆菌中
提取N- 糖酰胺酶F十分耗资和耗时,步骤繁琐多级化,并且产率低,每升发酵液只能获得
0.1~0.5 mg N-糖酰胺酶F[10],而且脑膜炎脓杆菌为病源菌,不适合大规模发酵.这些因素极大
的限制了N- 糖酰胺酶F的制备和应用.本研究中,将PNGase F基因连接到pET28a载体上,构
建了一个含有His- tag的重组表达载体.在大肠杆菌中经过低温诱导表达获得大量高纯度可溶性
表达的N-糖酰胺酶F.

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