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亲子活动感想重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-06 04:22

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2021年1月6日发(作者:月子里的宝宝三天没有拉大便老是放屁)
时间:
地点:
主讲:胡永珍
参加人员:

内容:重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用
国际上先后研制 出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主
要运用乙肝病毒携带者血清中 提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原,先后经过减毒处 理和添
加佐剂后注入人体预防接种。 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑,人们进一步着手开
发第二代乙肝疫苗,也就是基因重组疫苗。 第一步是分离目的基因,获得
目的DNA片段的方法主要有两种,一是直接从细胞基因组中分离,二是人 工合成。 第
二步是将DNA片段和载体在体外连接重组,成为重组DNA分子,多采用连接 酶的方法连
接。 第三步是基因克隆,即将重组体DNA分子,引进合适的宿主细胞(大肠杆 菌、酵
母)中增殖。根据所用载体的不同,可选用转化(以质粒作载体时,重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞,以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时,构成的重组体
DNA 分子,以此种方式进入宿主细胞,可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源
DNA组成的重组 体DNA分子,与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒,即人工包
装的噬菌体颗粒,引入宿主细胞 )的方法,往宿主细胞引入重组体DNA分子。 第四步
是目的基因克隆的筛选与鉴定,即从大 量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因
的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA 分子,为了获得摄取了重组体DNA分
子细胞,需经筛选,才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区 别开来,并作进一步鉴定。
筛选含有重组体DNA分子细胞的方法,一般都是以载体DNA及目的基因的 遗传标记及分
子特征为依据,并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药
物的抗性标记,因此,在含有一定浓度抗生素的选择培养基上,可以很容易地把摄取了重组
体D NA分子,因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面,依
据它只能判断质粒 载体是否进入了受体细胞,还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因
的重组体DNA分子。
对于重组体DNA分子的鉴别,通常是在抽提出重组质粒DNA后,用凝胶电泳法或电镜
观察其分子大小,用限制酶酶解,观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴
定,即将菌落 从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上,用碱裂解滤膜上的菌落,使
DNA分子游离,变性,并固 定在滤膜上,随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或
RNA探针杂交,最后通过滤膜的放射自显 影鉴定菌落,并从最初生长的平皿上挑选出放射
自显影呈阳性的菌落。 第五步是基因表达 ,这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源
DNA在宿主细胞中的转录和翻译,表达生成的产物(蛋白质) ,最好在细胞内不被分解,而
分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽,或是对细菌蛋白酶极为敏感的 蛋白质,形成后,
通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解,通常可以 把外
源基因插入在载体的某些结构基因中间,在这种情况下,表达产物是融合蛋白质,融合蛋白
质可以抵抗内源蛋白酶的降解,又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。最后,利用发
酵工程培养重 组与乙肝疫苗的工程菌 理化性质 从热稳定性方面说 酵母源乙型肝炎疫苗
37℃保存1周不改变其免疫原性 乙肝疫苗,主要成分是45个氨基酸的多肽, 通过化学合
成的方式制备,使用直接注射的方法打入静脉。这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位(所
谓表位,是一串大于9个氨基酸的多肽,是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片
段): ,HBscFv等电点理论值为 8.5 1,实验值为 7.3~ 8.1(就是抗体) 综上所述,用基< br>因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工
程菌、 乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理(如添加佐剂、
抗生素、除菌)、 成品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安
全性尤其重要。 目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种: (1)血源性乙肝疫苗:此
疫苗是用无症状的HBsA g携带者的血液制成,故称血源性乙肝疫苗。它的制备步骤大致是:
采用高滴度HBsAg阳性携带者血 液,分离出血浆并除去其中有感染的HBV颗粒后,再将
HBsAg予以浓缩与纯化,充分灭活,以消灭 其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表
面可能存在的全部宿主蛋白,然后添加佐剂及防腐剂而 成。为确保疫苗的安全,每一阶段均
取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等,以检查疫苗中有无其 他病原体及血液中的抗
原物质。此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决。 (2)基因工程疫苗: 利用基因工程
研制重组DNA乙肝疫苗,曾先后研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞
系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。目前多用酵母基因的重组疫苗。其具有良好的免疫原
性, 免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似,且多无严重的不良反应。 (3)含前S
蛋白的乙 肝疫苗:目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗,均只含HBsAg蛋白,当
证实S蛋白能增强H BsAg的免疫应答后,又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对血液透
析病人与新生儿免疫效果较差 时,遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗,它确
能明显地增强免疫应答。
基因 工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。在之前的研究中发现,
若选用细菌为基因 表达载体,即使使用强启动子,也不能得到大量具有免疫原性的基因表达
产物。这可能是由于原核表达系 统中不能进行糖基化修饰,或者原核细胞环境不适合专性寄
生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达,故应 选用真核表达系统。选用酵母(Saccharomyces
cerevisiae)作为宿主系统, 因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点,既可使蛋白以分泌形式
表达,又可以使蛋白糖基化变为活性形式 。克隆载体构建时,将编码HBsAg的基因(野生
型adw)添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ(ADHⅠ)的 启动子之后。如图1 所示构建载体。[6] 将
质粒转化至酵母菌中,通过HBsAg抗体与酵母菌积 累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出
成功转化的菌体。对筛选出的菌体进一步发酵培养,摸索合适 的基因工程菌培养条件,使产
物尽量高效积累

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