感染性腹泻诊断标准(申报)

2020年12月16日发(作者：甘渭汉)

C59

WS
中华人民共和国卫生行业标准

WS ×××－2005
------------------------------ -------------------------------------------------- -----------------







感染性腹泻诊断标准

Diagnostic criteria for infectious diarrhea
（报批稿）















2005－××－×× 发布 2005－××－××实施
中华人民共和国卫生部
发 布
WS ×××－2005
前 言


本标准是在GB17012-1997《感染性腹泻的诊断标准及处理原则》的基础上制定的,
GB17012-1997作废.。
本标准的附录附录A是规范性附录，B是资料性附录。
本标准由全国传染病标准委员会提出。
本标准由中华人民共和国卫生部批准。
本标 准起草单位：江苏省疾病预防控制中心及江苏省人民医院、南京市第二人民医院、
中国疾病预防控制中心 。
本标准主要起草人：汪华、阚飙、方肇寅、冉陆、赵 伟、李 军、朱凤才、史智扬、
顾 玲、郭喜玲、张雪峰。

WSXXX
―
2005

感染性腹泻诊断标准

１.范围
本标准规定了除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻的诊断标准。

2.术语和定义
2．1腹泻（diarrhea）：是指每日排便3次或以上，且粪便性状异 常，如稀便、水样便，
粘液便、脓血便或血便等。
2．2感染性腹泻（infectious diarrhea）：指由病原微生物及其产物或寄生虫所引起的、
以腹泻为主要临床特征的一组肠道传 染病。引起感染性腹泻的病原体繁多，其中主要的病
原及其引起的感染性腹泻病的流行病学和临床特征参 见附录B。
3.诊断依据
3.1 流行病学史
全年均可发病，但具有明显季节高 峰，发病高峰季节常随地区和病原体的不同而异；
细菌性腹泻一般夏秋季节多发，而病毒感染性腹泻、小 肠结肠炎耶尔森菌腹泻等则秋冬季
节发病较多。发病者常有不洁饮食（水）和或与腹泻病人、病原携带者 、腹泻动物、带菌
动物接触史，或有流行地区居住或旅行史；需排除致泻性的过敏原、化学药品暴露史及 症
状性、器官功能失调等非感染性腹泻病史。食（水）源性感染常为集体发病并有共进可疑
食物 （水）史；某些沙门菌（如鼠伤寒沙门菌）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、A组轮状病
毒和柯萨奇病 毒感染可在婴儿群体中引起爆发流行。
3.2 临床表现
3.2.1 每日大便次数≥3 次，粪便性状异常，可为稀便、水样便，粘液便、脓血便或
血便，可伴有恶心、呕吐、腹痛、发热、食欲 不振及全身不适。病情严重者，常并发脱水、
酸中毒、电解质紊乱、休克等，甚至危及生命。
3.2.2 已排除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒。
3.3 实验室检查
3.3.1 粪便常规检查：粪便有性状改变，常为粘液便、脓血便或血便、稀便、水样便；
镜检可有多量、少量或无红、白细胞。
粘液便、脓血便或血便，镜检可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、
肠出血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻；
稀便、水样便，镜检 可有少量或无红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、
隐孢子虫、气单胞菌等所致的腹泻。
3.3.2 病原体检查：从粪便、呕吐物、血等标本中检出霍乱弧菌、志贺菌、伤寒副伤
寒沙 门菌以外的病原体或特异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。（详见附录A）。
注：应用分子生物学方法开展病原体检测时，应遵照相关规定执行。

4. 诊断原则
临床诊断应综合流行病学资料、临床表现和粪便常规检查等进行。病原确诊则应依据
从粪便、呕 吐物、血等标本中检出病原体，或特异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。
5.诊断标准
5.1临床诊断病例：应同时符合3.2、3.3.1和或3.1。
5.2 确诊病例：应同时符合临床诊断和3.3.2。
6.鉴别诊断
6.1霍乱 由霍乱弧菌 感染所致。以剧烈腹泻起病，多数无腹痛，无里急后重；呕吐
多为喷射状，不伴恶心；呕吐物及腹泻物呈 米泔水样，量多，少数患者有洗肉水样便。脱
水严重者常引起肌肉痛性痉挛，皮肤皱瘪，体表温度低于正 常。粪便悬滴镜检可发现运动
极活泼的弧菌，应进一步作细菌培养，进行鉴别诊断。
6.2 伤寒与副伤寒 伤寒与副伤寒甲、乙型临床表现以高热、全身毒血症状为主，可
伴有腹痛，腹泻少见； 副伤寒丙型可呈胃肠炎型发作，病程短，预后好，多在3～5天内恢
复。血肥达氏反应阳性有助于伤寒诊 断；血、骨髓、粪便或尿等标本中培养出伤寒或副伤
寒杆菌即可确诊。
6.3 细菌性痢疾 由志贺菌属感染所致。腹泻以脓血便或粘液便较为常见，量少，常
有里急后重，多伴有畏寒发热。粪便镜 检可发现大量脓细胞、红细胞和巨噬细胞。粪便培
养可检出志贺菌。婴幼儿中毒型菌痢或不典型菌痢应通 过病原学诊断来鉴别。
6.4 阿米巴痢疾 由溶组织内阿米巴感染所致。潜伏期数周至数月，临床 表现多无发
热，腹痛轻，无里急后重；腹泻每日数次，量多，为暗红色果酱样血便，有腥臭味；镜检白细胞少，红细胞多，有夏科-雷登结晶，可找到溶组织内阿米巴滋养体。
6.5 非感染性腹泻 过敏性腹泻有接触过敏原史，既往有类似发作；药物性腹泻有服
用致泻药物史；酶缺乏性腹泻有遗传病家 族史。还有各种内外科疾病引起的症状性腹泻以
及器官功能失调性腹泻等，通过详细询问病史，结合相应 的检查结果进行鉴别。
附录A
（规范性附录）
实验室诊断方法
A1.沙门菌检验
A1.1标本的收集
根椐腹泻患者的病程及临床表现等，采集相 应的标本，发病第一周采血5ml，第二、
三周取粪便2～5g或尿液10～15ml,粪便挑取有脓血 、粘液部分，尿液留取中段尿或无菌
导尿。所采集的标本尽快检验，运送时间超过2h者，标本应放入C ary-Blair运送培养基
中，在冷藏条件下送检。
A1.2分离培养
A1.2.1直接分离培养
取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物（经3000转离心沉淀10～ 15min，倾去上清液）
标本接种于强选择性培养基(SS、BS、WS、HE琼脂等)和弱选择性培 养基（Mac、EMB琼脂）
平板各一块；血标本接种于血琼脂或营养琼脂平板，35℃～37℃培养1 8～24h，从平板上
挑取可疑菌落（详见表A1.2.1）进行鉴定。
A1.2.2增菌培养
取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物0.5～1g接种于10ml氯化镁 孔雀绿增菌液或四硫
酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐增菌液等；血液5ml接种于50ml葡萄糖肉汤或胆汁 葡萄糖肉汤
中，35℃～37℃增菌6～8h，挑取增菌液分离培养，培养同A1.2.1。

表A1.2.2沙门菌属在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
亚硫酸铋琼脂（BS）
菌落特征
还原亚硫酸铋菌落为黑色或墨绿色，菌落周
围培养基可呈黑色有金属光泽；有些菌株不
产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基
不变
无色半透明。
蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中
心黑色或几乎全黑色
无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带
黑色。
无色半透明。
EMB琼脂
HE琼脂
WS琼脂
SS琼脂
Mac琼脂
A1.3鉴定
A1.3.1镜检
沙门菌革兰氏染色显微镜下可见革兰氏阴性小杆菌，大小1～3×0.4～0.9μ。
A1.3.2生化试验
挑取可疑菌落移种于三糖铁（或KIA）和MIU上，并作氧化酶、硝 酸盐、KCN、赖氨酸
试验；或移种于沙门菌生化鉴定板（条）；或上微生物自动鉴定系统（仪）进行鉴 定。凡
生化反应符合表A1.3.2.1、表A1.3.2.2者，以沙门菌属诊断血清作玻片凝集试验 。
表A1.3.2.1沙门菌在三糖铁琼脂内的反应结果
类型
A1
A2
A3
A4
斜面
﹣
﹢
﹣
﹣
底层
﹢
﹢
﹢
﹢
产气
﹢﹣
﹢﹣
﹢
﹣
硫化氢
﹢
﹢
﹣
﹣
注：﹢表示阳性；﹣表示阴性；﹢﹣表示多数阳性少数阴性

表A1.3.2.2沙门菌生化反应结果
类型
B1
B2
B3
靛基质 尿素
﹣
﹢
﹣
﹣
﹣
﹣
KCN
﹣
﹣
﹣
硝酸盐 赖氨酸 硫化氢
﹢
﹢
﹢
﹢
﹢
﹢﹣
﹢
﹢
﹣
氧化酶
﹣
﹣
﹣
注：﹢表示阳性；﹣表示阴性；﹢﹣表示多数阳性少数阴性
A1.3.3血清凝集试验
O抗原试验 用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。被A
～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11等因子血清做凝集试
验。符合沙门氏菌属定义，A～F“O”多价血清不凝集，送有关部门进一步鉴定。
H抗原试验 先用多价H血清做凝集试验，如有一种或两种多价血清凝集，再用
这种多价血清的各种H因子血清检查以 确定第1相和第2相的H抗原。
Vi抗原试验 用Vi因子血清检查。
A1.4菌型的判定和结果报告
综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。
A2 肠致泻性大肠杆菌检验
A2.1 标本收集
采集病人急性期、用药前新鲜粪便、呕吐物标本（5克） ，尽快送检。运送时间超过
2h者，标本应放入Cary－Blair运送培养基中，在冷藏条件下送检 。
A2.2 分离培养
取新鲜粪便、呕吐物标本分别接种于对大肠杆菌抑制性较弱 的选择性鉴别培养基或其
它商品化的培养基。呕吐物标本亦可先经营养肉汤于37℃增菌培养，待有菌生 长后，挑取
1～2接种环转种至弱选择性培养基上，37℃培养24小时。
a）弱选择性 鉴别培养基：麦康凯琼脂或伊红－美蓝琼脂等。大肠杆菌发酵乳糖，在麦
康凯琼脂呈桃红色不透明菌落； 在伊红－美蓝琼脂上为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，
表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫 黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中
心较深的菌落。
b）肠出血性大肠杆菌需经mEC肉汤增菌液增菌6h，免疫磁珠捕获后，转种于 O157
显色培养基 和山梨醇麦康凯琼脂，肠出血性大肠杆菌O157：H7在这两种琼脂上分别为紫红
色和无色菌落，部分 菌株迟缓发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂上为红色菌落。
A2.3 初步鉴定
挑取可疑菌落作生化反应及与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者用单价血清
作进一步鉴定。
A2.4 鉴定
A2.4.1 肠致病性大肠杆菌（EPEC）
a）标本：水样或蛋花汤样便、呕吐物；
b）生化反应符合大肠杆菌特征；
c）血清学鉴定符合EPEC血清型（表A2.4）。
表A2.4 常见肠致泻性大肠杆菌的O血清群及血清型
常见肠致泻性大肠杆菌的Ｏ血清群及血清型
婴幼儿腹泻 成人和儿童腹泻
EPEC ETEC EIEC EHEC EAEC
O
20
O
26
O
44
O
6
:K
15
:H
16
O
8
:K
40
:H
9
O
28
ac O
157
:H
7
O
9
:K
99


O
55
O
86
O
111

O
114
O
119
O
125

O
126
O
127
O
128

O
142
O
158






O
8
:K
25
:H
9
O
8
:H
47
:H
-

O
11
:H
27
O
15
:H
11

O
20
:H
-
O
25
:K
7
:H
42

O
25
:K
98
:H
-
O
27
:H
7

O
27
:H
20
O
63
:H
12

O
73
:H
45
O
78
:H
11

O
78
:H
12
O
85
:H
7

O
114
:H
21
O
115
:[H
51
]
1)

O
127
:H
12
O
128
:H
7

O
112

O
124

O
136

O
143

O
144

O
152

O
164



O
26
:K
62
:H
11
O
101
:K
99

O
111






















O
128
:H
21
O
139
:H
28

O
148
:H
28
O
149
:H
4

O
159
:H
4
O
159
:H
20

O
159
:H
34
O
166
:H
27

O
169
:H
-

1)无动力的变异


















d）PCR检测eae基因：引物对为
SK1SK2，
扩增片段长度为< br>881bp，
序列如下：
SK
1
：
5′-
CCCG AATTCGGCACAAGCATAAGC
-3′
，

SK
2：
5′-
CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
-3′
PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；
1.5 mM MgCl
2
；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM dNTP；5μlDNA模板；引物
SK
1
和 SK
2
各
0.125
μm；补足DH
2
O至50μl。同时 设阴性和阳性对照。
PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1 min,72℃延伸1min,共35
个循环,最后一个循环72℃延伸10min。
电泳及 结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到
扩增目的片段长度 为
881bp
判为阳性。
A2.4.2 肠产毒性大肠杆菌（ETEC）
a）标本：霍乱样水样便、呕吐物；
b）生化反应符合大肠杆菌特征；
c）血清学鉴定符合ETEC血清型（表A2.4）；
d）检出大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）和／或 耐热肠毒素（ST）。测定LT可用兔肠段
结扎试验、皮肤试验、ELISA、Biken试验、平板免 疫溶血试验、DNA探针杂交和聚合酶
链反应（PCR）等方法；测定ST可用乳鼠灌胃试验、ELIS A、PCR、DNA探针杂交等方
法。
PCR同时检测elt和est基因：引物对分别为L T
L
／LT
R
和AL
65
／AL
125
， 扩增片段长度
分别为
322和147bp，
序列如下：
LT
L：5′-
TCTCTATGTGCATACGGAGC
-3′
LT
R：5′-
CCATACTGATTGCCGCAAT
-3′
AL
65< br>：5′-
TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
-3′

AL
125
：5′-
CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3′
PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；

1.5 mM MgCl
2
；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM dNTP；5μlDNA模板； 引物LT
L
和
LT
R
各
0.25
μm；引物AL< br>65
和AL
125
各
0.5μm；
补足DH2O至50μl。

PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,7 2℃延伸1min,共35
个循环,最后一个循环72℃延伸10min。
电泳及结果判断： PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察
到扩增目的片段长度为
322和（或）147bp
判
为elt和（或）est基因
阳性。
B2.4.3 肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）
a）标本：细菌性痢疾样便、呕吐物；
b）生化反应：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O124外无动力，酒石酸盐阴性，
赖 氨酸脱羧酶阴性；
c）血清学鉴定符合EIEC血清型（表A2.4）；
d）豚鼠角膜 结膜试验（Sereny试验）、Hela细胞侵入试验阳性、PCR或DNA探针检
测侵袭基因。 < br>PCR检测ipaH基因：引物对为
ipaIII
／
ipaIV
，扩增 片段长度分别为
619bp
序列
如下：
ipaIII：
5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC
-3′

ipaI V：
5′-
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
-3′
PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；
1.5 mM MgCl
2
；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM dNTP；5μlDNA模板；引物
ipaIII和ipaIV
各
0.125μm；补足DH
2
O至50μl。同时设阴性和阳性对照。 < br>PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1m in,共35
个循环,最后一个循环72℃延伸10min。
电泳及结果判断：PCR产物在 2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到
扩增目的片段长度为
619bp< br>判为阳性。
A2.4.4 肠出血性大肠杆菌（EHEC）
a）标本：早期为水样便，后为血便、呕吐物；
b）生化反应：不发酵或迟缓发酵山梨醇，赖氨酸 、鸟氨酸、鼠李糖、蔗糖、密二糖阳
性，精氨酸、苦杏仁甙阴性；
c）血清型鉴定：其血清型 为O157：H7（其中H7鞭毛抗原需用采用试管凝集试验法
进行鉴定），O26：K62：H11、 O111（表B1）；O157：H7的血清型亦可采用PCR检测O157
※
和H7特异性基 因的方法鉴定,引物序列见表A2.4.4。
表A2.4.4 O157:H7特异基因检测引物序列及扩增片段长度
引物名称
O157-F
O157-R
flicH7-F
flicH7-R
引物序列
5′-TTCAAACAGAGGACCATC-3′
5′-CCCAGCCACTAAGTATTG-3′
5′-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3′
5′-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3′
目的基因
片段大小(bp)
636

625

rfbO157

flicH7

O157 O抗原特异基因检测: 反应总体积为25ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10×
Buffer2.5ul, 2mmolL dNTPs 2.5ul，引物各0.5ul（10pmolul），Taq酶1U ，模板1u l，补足
无DNA、RNA酶水至25ul，石蜡油封盖。反应程序：94℃5min，模板DNA预变 性；然
后94℃1min，63℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸5min。 每次试验均设阴、
阳性对照及空白对照。
鞭毛抗原H7特异基因检测: 反应总体积为50ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10×
Buffer 5ul, 2mmolL dNTPs 5ul，引物各0.25ul（10pmolul），Taq酶1U ，补足无DN A、
RNA酶水至50ul，模板1ul，石蜡油封盖。反应程序及试验对照均同O抗原特异基因检测。
d）Vero细胞培养法检测VT毒素，或送上一级有条件CDC进行PCR检测VT1、VT2、eaeA和Hly毒力基因。
A2.4.5 肠集聚性粘附大肠杆菌（EAggEC）
a）标本：水样便、呕吐物；
b）生化反应：生化反应符合大肠杆菌特征；
c）Hep-2细胞粘附试验检测细菌对细胞的集聚性粘附或PCR、DNA探针技术检测特异性
基因 。
PCR检测aggR基因：引物对为aggRks1／aggRkas2，扩增片段长度分别为25 4bp序列
如下：
aggRks1：5′-GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3′
aggRkas2：5′-ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3′
PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；
1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM dNTP；5μlDNA模板；引物aggRks1和aggRkas2
各 0.25μm；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。
PCR反应程序：95℃预变性1 0min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个
循环,最后一个 循环72℃延伸10min。
电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝 胶成像系统中观察
到扩增目的片段长度为254bp判为阳性。
A2.4.6 肠致泻性大肠杆菌种间鉴别：
引物对SK
1
SK
2
、VTcom- u／VTcom-d、LT
L
／LT
R
、AL
65
／AL< br>125
、ipaIII／ipaIV和aggRks1
／aggRkas2分别检测ea e、stx、elt、est、ipaH和aggR基因。详见表A2.4.6
表A2.4.6 多重PCR法鉴别肠致泻性大肠杆菌引物序列
引物名称
SK
1

SK
2

VTcom-u
VTcom-d
AL
65

AL
125

LT
L

LT
R

ipaIII
ipaIV
aggRks1
aggRkas2
引物序列
5′- CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3′
5′- CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3′
5′- GAGCGAAATAATTTATATGTG-3′
5′- TGATGATGGCAATTCAGTAT-3′
5′- TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3′
5′- CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3′
5′- TCTCTATGTGCATACGGAGC-3′
5′- CCATACTGATTGCCGCAAT-3′
5′- GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3′
5′- GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′
5′- GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3′
5′- ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3′
目的基因
eae

stx

est

elt

ipaH

aggR

片段大小 (bp)
881

518

147

322

619

254

PCR反应体积为50μl：10 mM Tris- HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；
1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM dNTP；5μlDNA模板；引物SK< br>1
、SK
2
、ipaIII
和ipaIV各0.125μm；引物VT com-u、VTcom-d、LT
L
、LT
R
、aggRks1和aggR kas2各0.25
μm；引物AL
65
和AL
125
各0.5 μM；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。
PCR反应程序：95℃预变性10min ；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个
循环,最后一个循环72 ℃延伸10min。
电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系 统中观察
到扩增目的片段长度分别如表中所述则判相应基因为阳性。
综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。
A3.副溶血性弧菌检验
A3.1标本的收集
急性期、用药前采集病人新鲜粪便标本2～5g或2～5ml，所采集标 本尽快检查。运送
时间超过2h者，标本应放入Cary- Blair运送培养基中，室温条件下运送实验室。
A3.2分离培养
A3.2.1直接分离培养
取新鲜粪便接种于氯化钠蔗糖琼脂或35gL氯化钠琼脂或TC BS琼脂等选择性培养基，
35℃～37℃培养18～24h，从平板上挑取可疑菌落（详见表A3.2 .2）做进一步鉴定。
A3.2.2增菌培养
取新鲜粪便0.5～1g或0.5～ 1ml接种于10ml氯化钠结晶紫增菌液（副溶血性弧菌增
菌液）或碱性蛋白胨水等增菌液，35℃～ 37℃培养6～8h，挑取增菌液分离培养，培
养同A3.2.1。副溶血弧在培养基上生长特性见表A 3.2.2
表A3.2.2副溶血性弧菌在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
氯化钠蔗糖琼脂
35gL氯化钠琼脂
TCBS琼脂
A3.3鉴定
A3.3.1镜检
挑取可疑菌落涂片镜检，副溶性弧菌革兰氏染色后 显微镜下可见革兰氏阴性无芽胞杆
菌,细菌形态多变,有杆状、弧状、丝状及球状。不同的培养基上生长 的菌体差异很大：在
高盐琼脂上呈球杆状；在血琼脂上主要呈卵圆形，少数球杆状也有丝状。悬滴标本运 动活
泼。
A3.3.2生化试验
挑取可疑菌落转种三糖铁培养基并作氧化酶、耐盐 生长试验，并接种蔗糖、V-P、甲
基红等生化反应培养基。具体内容见表A2。
A4结果报告
综合镜检和生化反应结果判断菌型并报告结果。
菌落特征
因不发酵蔗糖菌落近似培养基颜色，绿
色或蓝绿色
菌落无色不透明
因不发酵蔗糖菌落而呈绿色或蓝绿色
表A2 致病性弧菌鉴定表

项目
霍乱
弧菌
37
+
+
+
+-
-
+
+
-
-
-+
+
+
+
-
-
-
+

＋
＋
＋／
－
－

S
S
Y
拟态
弧菌
37
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
－
－
＋／
＋
＋
－
－
－
－
＋

＋
＋
＋／
－
－

S
S
G
副溶血
弧菌
37
＋
＋
＋
－
－／＋
＋
＋
－
－
－
＋
＋
－
＋
－
－
＋

－
＋
＋
＋
－

R
S
G
创伤
弧菌
37
＋
＋
＋
－
－
＋
＋／－
－
－
＋
＋
＋／－
－／＋
－
＋
＋
＋

－
＋
＋／－
－
－

S
S
GY
溶藻
弧菌
37
＋
＋
＋
＋／－
－
＋
＋／－
－
－
－
＋
＋
＋
－
－
－
＋

－
＋
＋
＋
＋／－

R
S
Y
辛辛那提
弧菌
25,35
＋
＋
－
＋
－
＋
－
－
－
－
＋
－
＋
＋
＋
＋
－

－
＋
＋
－
－

R
S
Y
河弧
菌
37
＋
＋
－
－
－
－
－
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
－／＋
－
＋

－
＋
＋／－
－
－

R
S
Y
弗尼斯
弧菌
37
＋
＋
－
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
－／＋
－
＋

－
＋
＋／－
－
－

R
S
Y
雀周鱼弧菌（少
女鱼弧菌）
25
＋
＋
－
＋
＋
＋／－
－
＋
－／＋
－
＋
－
－
－
－
－
－

－
＋
＋
－
－

S
S
G
霍利斯
弧菌
25,36
＋
＋
＋／－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
＋
－
－
－

－
＋
＋／－
－
－

R
S
G-
麦氏
弧菌
37
－
－
＋／－
＋／－
－
－／＋
－
＋／－
－
＋／－
＋
＋
＋
－
－
－
－

－
＋
＋
＋／－
－

S
S
Y
气单胞
菌
28
＋
＋
＋／－
＋／－
－
－
－
＋
＋／－
－／＋
＋
＋
＋／－
＋／－
＋／－
＋／－
＋

＋
＋
－
－
－

R
R
－
邻单胞菌
最适生长温度
氧化酶
硝酸盐还原
靛基质
ＶＰ
尿素酶
Ｌ－赖氨酸
Ｌ－鸟氨酸
Ｌ－精氨酸
葡萄糖产气
乳糖
麦芽糖
Ｄ－甘露醇
蔗糖
Ｌ－阿拉伯糖
纤维二糖
水杨素
明胶酶
在不同盐量肉汤中生长试验
0%NaCl
3%NaCl
6%NaCl
8%NaCl
10%NaCl
O129敏感性
10ug
150ug
TCBS生长
37
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
＋
－
－
＋／－
－
－
－
－
＋／－
－

＋
＋
－
－
－

RS
S
－
A4弯曲菌检验方法
A4.1标本收集
于急性期、用药前采集病人新 鲜粪便标本10g，立即送实验室进行培养，运送时间超过
2h者，应放入Cary-Blair运送培 养基，4℃冷藏送检；或将粪便标本直接接种增菌肉汤，并
置于微需氧环境下，室温条件下运送。
A4.2粪便标本直接镜检
急性期患者的粪便可直接作涂片检查，革兰氏染色或用0.3％碱 性复红单染色镜检，弯
曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。液体标本在 暗视野
显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性，提示弯曲菌感染。
A4.3分离培养方法
A4.3．1培养条件
本菌为微需氧菌，在6% O
2
, 7% CO
2
, 7% H
2
,80% N
2
条件下生长最好。
可以使用①混合气体法；②烛缸培养法；③微需氧产气袋法。
A4.3．2直接培养
急性期、用药前采集的病人新鲜粪便标本可直接划线接种CCD琼脂平板（
Charcoal,
cefoperazone, desoxycholate agar
）平板，37
o
C
微需氧培养24~72h。
A4.3．3增菌培养
病人新鲜粪便标本 5g接种弯曲菌增菌肉汤（Preston肉汤），37
C
微需氧培养24~72h
后 划线接种CCD琼脂平板，37
C
微需氧培养24~72h。
B4.3．4可疑菌落在培养基上的形态特征（列表形式）
弯曲菌在CCD琼脂平板为灰色、湿润、沿 划线生长，菌落常常不是规则圆形的。空肠
弯曲菌通常为灰绿色的菌落，有金属光泽或无。结肠弯曲菌的 菌落为奶油灰，湿润、突起。


A4.4鉴定
A4.4．1镜检
A4.4.1.1革兰氏染色镜检
弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。
A4.4.1.2暗视野显微镜镜检
液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性。
o
o
A4.4．2生化鉴定
将可疑菌落划线接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯，37℃微需氧 培养48h。挑取菌落
做生化反应进行确证。弯曲菌的生化鉴别见表A4.4.2。
表4.4.2 弯曲菌属种的生化鉴别表
空肠弯曲菌结肠弯曲菌红嘴鸥弯曲菌
Campylobacter jejuni

过氧化氢酶试验
氧化酶试验
马尿酸盐水解试验
吲哚乙酸酯水解试验
马尿酸盐水解试验
+
+
+
+
Campylobacter coli

+
+
－
+
Campylobacter lari

+
+
－
－
用接种环自哥伦比亚血琼脂平板刮取菌苔，接种到0.4mL含 1％的马尿酸钠溶液中，振
摇试管以分散培养物，置37℃培养2h 。然后向试管中加入0.2ml茚 三酮试剂，将试管于
37℃放置10min，出现紫／蓝色者为阳性反应，无色或灰色为阴性反应。以阴 性菌和阳性菌
做对照。
吲哚乙酸酯水解试验
取50 uL含10％的吲哚乙酸酯溶 液，将其浸入到直径为6mm的纸片上，将纸片在空气
中晾干。挑取可疑菌落生长物，将其直接涂布在纸 片上，同时滴加一滴无菌蒸馏水，观察
5-10min。纸片显示蓝绿色为弯曲菌反应阳性。
A4.5 菌种保存
哥伦比亚血平板37℃ 微需氧培养48h，刮取菌苔，悬浮于含20％甘油的脑心肉汤， 置
于－70℃冰箱保存。复苏时，将 整菌种管取出化冻并摇动均匀后，整管转种不加抗菌素的弯
曲菌增菌肉汤37℃ 培养48~72h。
A4.6结果报告
根据A4.1、A4.2结果，报告是否检出空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。
腹泻病人同时感染空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的情况很常见。
A4.7培养基
A4.7.1 弯曲菌增菌肉汤：
A4.7.1.1 成份



A组
布氏肉汤



B组
弯曲菌生长促进剂


C组
抗生素



D组
A4.7.1.2 制法

Lab-Lemco 牛肉粉
蛋白胨
氯化钠
蒸馏水

丙酮酸钠（Sodium pyruvate）
焦亚硫酸钠（Sodium metabisulphite）
硫酸亚铁（Ferrous sulphate）

多粘菌素B（Polymyxin B）
甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim）
利福平（Rifampicin）
放线菌酮（Cycloheximide）
冻融的马血（或脱纤维兔血）

10 g
10 g
5 g
1000m L

0.25 g
0.25 g
0.25 g

5000i.u
10mg
10mg
100mg
50mL
A组各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.0±0.2。装瓶，每瓶100m L。121℃高压
灭菌15min，备用。此为布氏肉汤基础培养基。
临用前，每100mL 布氏肉汤基础培养基中加入冻融的马血（或脱纤维兔血）5mL、B
组混合液0.5mL和C组抗生素混 合液0.5mL，摇匀备用。
B组混合液的制备：丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁均称取0.125 g，加入2mL无菌
蒸馏水，摇匀备用。
C组抗生素混合液的制备：分别称取多粘菌素B 1 0mg、甲氧苄氨嘧啶10mg、利福平
10mg和放线菌酮100mg，加入2mL的1：1丙酮和无 菌蒸馏水溶液，摇匀备用。
在对抗生素进行操作时安全注意事项：①使用的抗生素中包含有放线菌酮， 如接触到皮
肤，应立即用大量肥皂水冲洗；②穿适当的保护性衣服，带手套。

A4.7.2 CCD琼脂
A4.7.2.1 成分


布氏肉汤
Lab-Lemco 牛肉粉
蛋白胨
氯化钠
微生物用碳粉
酪蛋白水解产物
脱氧胆酸钠
硫酸亚铁
丙酮酸钠
琼脂
蒸馏水
头孢哌酮（Cefoperaone）
两性霉素B（Amphotericin B）
A4.7.2.2制法
25 g
10g
10g
5g
4 g
3 g
1 g
0.25 g
0.25 g
12 g
1000m L
32 mg
10 mg
除抗生素外，各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.0±0.2。1 21℃高压灭菌15min，
冷却至50℃，加入抗生素混合液0.5mL（以水为溶剂），摇匀，倾注 平板。平板要密封避光
保存，使用前置37℃过夜。
操作头孢哌酮和两性霉素B要注意安全保护，穿适当的保护性衣服，带手套。
A5 小肠结肠炎耶尔森菌的检验
A5.1 标本的收集
于急性期使用抗生素前 采集粪便标本和血液等标本，立即送实验室进行检测，运送时间
超过2h者，应放入Cary- Blair运送培养基，4℃冷藏送检。血液标本应先进行增菌。
A5.2 分离方法
可直接接种于麦康凯培养基等选择性琼脂平皿上，26℃培养24～48h。同时取约1g标
本接种于1 0mL改良磷酸盐缓冲液，于4℃分别增菌培养7天、14天和21天后取增菌培养
物转种于麦康凯平板 ，26℃培养24～48h。
A5.3 挑选可疑菌落
挑取可疑菌落，分别接种改良克氏双 糖琼脂，26℃培养24h。将改良克氏双糖琼脂上、
下两层均产酸且不产硫化氢者转种Rustigi ans尿素培养基，尿素阳性者分别转种两支半固
，
体培养基，分别置于26℃和37℃培养2 4 h。26℃有动力且37℃无动力者为小肠结肠炎耶尔
森菌疑似菌株，分别进行生化鉴定和血清分型。
A5.4 生化鉴定
所有的生化反应均在26℃培养。本菌主要生化反应情况见表A5.4
表A5.4典型小肠结肠炎耶尔森菌主要的生化反应情况
项目
动力25℃
37℃
V-P 25℃
37℃
靛基质
硝酸盐还原
卵磷脂
?-半乳糖苷没酶
甲基红
枸橼酸盐
结果
+（—）
—
+（—）
—
V
+
V
+
+
V
项目
苯丙氨酸脱氨酶
氧化酶
葡萄糖产气
尿素酶
乳糖酐（氧化）
鸟氨酸脱羧酶
精氨酸脱羧酶
赖氨酸脱羧酶
D-树胶醛糖
D-树胶醛糖
结果
—
—
—
+
+
+
—
—
—
+
项目
蜜二糖
鼠李糖
蔗糖
棉子糖
山梨糖
蕈糖
木胶糖
七叶灵
水杨苷

结果
—（+）
—（+）
+（—）
—（+）
+
V
V
V
V

注：+（—）：多数菌阳性，少数菌阴性；—（+） ：多数菌阴性，少数菌阳性；V：不同生物
型结果不同

A5.5 血清学检查
本菌具有菌体O抗原和鞭毛H抗原。用现在国际常报告的80多个O抗原因子，可将
本菌分 成不同血清型。目前我国已报告的血清型有54个。
A5.6 毒力基因检测
PCR法检测小肠结肠炎耶尔森菌ail、ystA、ystB、yadA、virF毒力基因。
A6 轮状病毒检验
A6.1 标本收集
A6.1.1 粪便：收集患者早期腹泻粪便约1 0g或10mL，置无菌容器内，冷藏运送至实验室，
4℃或－20℃保存备检。
A6.1.2 血液标本： 如做抗体测定，必须采集2份血清标本。第1份(急性期)在发病时尽早采集，第2份在发病后1个月左右采集。无菌条件下抽取5m1血液，置于消毒试管。室温放
置2 h，待凝固后分离血清。
A6.2 实验室检查（可采用下列方法之一检验）
A6.2.1 电镜检查 ：直接电镜或免疫电镜检查病毒颗粒。
A6.2.1.1 腹泻患者粪便上清液0.2～0.5ml。
A6.2.1.2 直径约为3mm的铜网,每网为200 目,以0.25%Formvar制备铜网上的支持膜,
干燥后备用。
A6.2.1.3 染色液：1%醋酸铀或2.5%磷钨酸。
A6.2.1.4 血清：(1) 病人恢复期血清(1：5或1：10稀释)；(2) 兔抗ADRV诊断血清,
其效价1：64(对流免 疫电泳)以上,用时以生理盐水作1：20～1：50稀释。
A6.2.1.5 直接电镜法：取腹泻 患者粪便上清液约0.2～0.5ml,加等量氯仿,振摇3～
5min,3000rmin离心15～ 25min,取其上相液,用微量吸液器滴入有支持膜的铜网上,1～2min
后,用滤纸轻轻吸去铜网 上的液体, 自然干燥待检。对标本负染。用染色液染1min,吸去多余
染液,干燥后上电镜观察。电 镜下观察标本中的病毒颗粒，见到特殊轮形的病毒即可确定。
A6.2.1.6 免疫电镜：取经30 00rmin离心的粪便上清液50～100μl,加入病人恢复期
血清或兔抗ADRV血清(稀释后) 50～100μl混合,37℃作用1小时,4℃过夜。将铺于载玻片
上1%琼脂糖(厚约3mm)用刀 片切成1×1的方块,置于3层滤纸上,用毛细吸管将抗原-抗体作
用液滴在小方形的琼脂糖块上,迅速 将铜网放在液滴上,待铜网几乎贴在琼脂糖块上时,取下
铜网, 用滤纸轻轻吸去铜网上的液体, 自然干燥后用染色液染1min,吸去多余染液,干燥后
上电镜观察，见到特殊轮形的病毒即可确定。
A6.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):将粪便标本用PBS稀释成10%，加SDS（终浓 度为
1%）于56℃30min处理后用等量酚、氯仿简单抽提病毒RNA，用10%不连续聚丙烯酰胺 凝胶
电泳后用硝酸银染色，可见清晰、典型的11条dsRNA条带，根据电泳图型判定结果。
A6.2.2.1 A组轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原，电泳图可见11条RNA区带分四组，< br>其排列为4.2.3.2。依据第Ⅳ组10和11 RNA片段电泳距离不同，把轮状病毒分为两个亚群：
亚群I为短型（S型），两片段距离短；亚群Ⅱ为长型（L型），两片段距离长。
A6.2.2.2 B组轮状病毒即成人腹泻轮状病毒，主要引起青壮年腹泻。11条RNA电泳图的分布模式为4.2.1.1.1.1.1（或描述为4.2.2.3），第7.8.9节段明显分开。
A6.2.2.3 C组轮状病毒，主要引起婴幼儿腹泻， 11条RNA电泳图的分布模式为4.3.2.2，
易于与A组和B组轮状病毒区别。
A6.2.3 琼脂糖凝胶电泳：提取的病毒RNA直接用1%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h, 溴化乙
锭染色后紫外灯下或凝胶成像系统观察，依据电泳图型判定结果。电泳图型的分布模式从上
到下 为3.2.3 .2 的规律。此外,还可以根据第4 组2 个片段迁移率上的差别,把A 组轮状
病毒分成长型和短型,此法比PAGE电泳分析简单快速，但检测灵敏度较低。
A6.2.4 ELISA检测法：检测病毒颗粒和抗原。有商品试剂盒供应，试验按常规方法进
行。
A6.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）:从粪便标本中可检测出浓度很低的轮状病毒。根据病毒VP7或VP4基因在不同型的轮状病毒株间有高度变异而在同型毒株之间这一变异区
高度 保守的特征，运用逆转录后巢式PCR可区分轮状病毒的不同基因型，并可检测到不同轮
状病毒的混合感 染。根据检测不同基因片段的需要有多种引物序列可以选择，详见表A6.3。
PCR反应体系及反应条 件按选择的试剂及扩增仪而有所不同。扩增产物按常规进行电泳及结
果判断。

表A6.3用于轮状病毒核酸检测及基因分型的寡核苷酸引物
引物
名称

Pr1
Pr2
Beg9
End9
RVG9
aBT1
aCT2
aET3
aDT4
Con3
Con2
Con3
1T1
2T1
3T1
4T1
5T1
引 物
极 性
RV(+)
RV(-)
G(+)
G(-)
G(-)
G1(+)
G2(+)
G3(+)
G4(+)
P(+)
P(-)
P(+)
P1(-)
P2(-)
P3(-)
P4(-)
P5(-)

A6.4 病毒分离
片断
退 火
大小
温 度
（bp）
（℃）

58
42
362
1062

42
749
652
374
583
42

877

346
42
484
268
392
584
分 型 用 途 序 列（5-3）
‘’
A组轮状病毒通用引物
G血清分型
第一轮引物
G血清分型
第二轮共用引物

G2血清型特异引物
G3血清型特异引物
G4血清型特异引物
P血清分型
第一轮引物
P血清分型
第二轮共用引物
P1血清型特异引物
P2血清型特异引物
P3血清型特异引物
P4血清型特异引物
P5血清型特异引物
GGT TAGCTCCTTTTAATGTATGGT
ACTGATCCTGTTGGCCATCC
GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG
GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG
GGTCACATCATACAATTCT
CAAGTACTCAAATCAATGATGG
CAATGATATTAACACATTTTCTGTG
CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG
CGTTTCTGGTGAGGAGTG
TGGCTTCGCCATTTTATAGACA
ATTTCGGACCATTTATAACC
TGGCTTCGCCATTTTATAGACA
TCTACTTGGATAACGTGC
CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC
TGTTGATTAGTTGGATTCAA
TGAGACATGCAATTGGAC
ATCATAGTTAGTAGTCGG
A6.4.1 细胞系：原代非洲绿猴肾或传代非洲绿猴肾细胞（MA104）细胞等。
A6.4.2细胞培养基成分：EagLe's 培养液、3%谷氨酰胺、青链霉素（10,000μm l、10,000
μgml）、胎牛血清、7.5%碳酸氢钠,10μgml 结晶胰酶。
A6.4.3 生长液：100ml EagLe’s 生长液中包含EagLe’s液84ml、胎牛 血清10ml、
青∕链霉素2ml、3%谷氨酰胺1ml，7.5%碳酸氢钠调液体pH值至7.2～7 .4。
B6.4.4 维持液：100ml EagLe’s 维持液中包含EagLe’s液92m L、胎牛血清2ml、青∕链
霉素2ml、3%谷氨酰胺1ml，7.5%的碳酸氢钠调液体的pH值至 7.2～7.4。
A6.4.5 实验步骤
粪便上清液0.2ml～0.5ml先加青链霉素0.2ml 4℃过夜处理或用0.45um除菌滤器过滤，
将标本用终浓度为10ugml 结晶胰酶在37℃作用 30min，接种到生长至80%单层细胞管，
37℃吸附1h，弃去标本液，换上细胞维持液（含胰酶 0.5～1.0ugml），在37℃孵育至出现
细胞病变，按照上述方法在细胞内连续传代三次。用特 异免疫血清作中和试验进行鉴定。对
于粪便标本中轮状病毒的初次分离，最好先在原代细胞上传几代适应 后再传至MA104细胞大
量增殖。 一般实验室限于条件，不宜做到病毒分离。
A7 诺瓦克病毒检验
A7.1 标本采集
A7.1.1粪便标本应在发病首日采集,至多不能超 过发病急性期(48～72h)。每份标本量
约10～50ml。25～48h采集的粪便标本，阳性检 出率最高。
A7.1.2 病人呕吐物是粪便标本的最佳补充,有助于病原的诊断。
A7.1.3若是饮用水,需用大容量(5～100L) 浓集病毒后检测。从流行病学角度出发,在
水、食物或其它外环境标本中检出诺瓦克病毒有重要意义。
A7.1.4 采集患者急性期(发病5 天内) 和恢复期(发病3～6 周)血清,－20℃长期保
存。
A7.2 实验室检查
A7.2.1 电镜检查：实验方法同轮状病毒电镜检查。
A7.2.2 ELISA 方法：通过纯化的重组杆状 病毒高效表达的诺瓦克病毒衣壳蛋白作为抗
原,直接检测病人血中特异性IgG抗体。因存在隐性感染情 况,需确认患者急性期和恢复期双
份血IgG抗体滴度出现≥4 倍增长。
A7.2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
A7.2.3.1按常规提取病毒RNA作为模板。引物设计选择病毒RNA 聚合酶区域。可选择
下列引物对之一进行逆转录聚合酶链反应。
用于诺瓦克病毒核酸检测寡核苷酸引物：
引 物
P289
P290
P3
P51
引 物 序 列
5′-TGA CGA TTT CAT CAT CAC CAT A-3′
5′-GAT TAC TCC AGG TGG GAC TCC AC-3′
5′-GCA CCA TCT GAG ATG GAT GT-3′
5′-GTT GAC ACA ATC TCA TCA TC-3′
206
片段大小(bp)
319
A7.2.3.2反应体系及反应条件按选择的试剂及扩增仪有所不同。 扩增产物按常规进行
电泳及结果判断。
A8 肠腺病毒检验
A8.1 标本采集：同A6.1
A8.2 实验室检测
A8.2.1 ELISA方法：有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。
A8.2.2 聚合酶链反应（ PCR方法）
A8.2.2.1 常规方法提取标本中病毒DNA作为模板。
A8.2.2.2采用与Ad40 及Ad41 六邻体基因高度保守区互补引物扩增腺病毒DNA。引物
hexAA1885的序列为: 5′-GCC GCA GTG GTC TTA CAT GCC ACA CTC-3′；引物hexAA1913 的
序列为:5′- CAG CAC GCC GCG GAT GTC AAA GT - 3′
A8.2.2.3 反应体系：10×buffer 5μl(含1.5mmolL MgCl2),2mmolLdNTPs 5μl,引物
hexAA1885 和hexAA1913 各0.8μmol L 、1.5U TaqDNA 酶、5μl提取的模板DNA，补足DH2O
至50μl。
A8.2.2.4 反应条件: 94 ℃预变性3min ,94℃变性40 s ,55℃退火40 s ,72℃延伸40 s ,
共35个循环,最后一个循环延伸10min。PCR产物电泳及观测按常规进行，扩增目的片段为
30 0bp。
A8.2.2.5 扩增产物的限制性内切酶分析（病毒分型）
按 PCR 产物纯化试剂盒说明书操作，纯化PCR 扩增产物。取10μl PCR 扩增产物加2～
5 U 限制性内切酶RsaⅠ,总反应体积20μl。 置37 ℃水浴中过夜。取10μl 酶切产物进行
1%琼脂糖(含荧光染料) 电泳,标准分子量Marker作参照，置紫外光下或凝胶成 像系统观察。
纯化的扩增产物经RsaⅠ酶切后可清楚地将肠道腺病毒40型和41型区别开,Ad40 被水解为
256bp和45bp两个片段,Ad41被水解为211bp和90bp两个片段。
A8.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析：取DNA标本20μl加限制性内切酶SmaI 50U,10倍 SmaI酶缓
冲液5μl，再加蒸馏水至50μl，混匀后37℃振荡水浴1h，70℃水浴5min终 止酶解。取酶解
物进行琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外光下或凝胶成像系统观察，腺病毒40和41 型分别
显示独特的酶切图谱。排列模式3.2.2.1为腺病毒40型, 排列模式3.3.3.1和3.3.4.1为腺病
毒41型.
A8.2.4 病毒分离
A8.2.4.1 细胞系：腺病毒40和41型能在Grahm293细胞、张氏结膜细胞和第三代食 蟹
猴肾细胞（tCMK cells）中生长。但Grahm293细胞目前是腺病毒最敏感的细胞。
A8.2.4.2 细胞培养基成分：EagLe's 培养液、3%谷氨酰胺、青链霉素（10,00 0uml,10,000
μgml）、胎牛血清、7.5%碳酸氢钠。
A8.2.4.3 生长液：100ml EagLe’s 生长液中包含EagLe’s液84ml、胎牛血清10ml、
青∕链霉素2ml、3%谷氨酰胺1ml，7.5%碳酸氢钠调液体pH值至7.2～7.4。
A8.2.4.4 维持液：100ml EagLe’s 维持液中包含EagLe’s液92ml、 胎牛血清2ml、
青∕链霉素2ml、1%谷氨酰胺1ml，7.5%的碳酸氢钠调液体的pH值至7. 2～7.4。
A8.2.4.5 实验步骤
粪便上清液0.2～0.5ml先加青链霉素0.2ml 4℃过夜处理或用0.45um除菌滤器过滤 ，
接种到生长至80%单层细胞管，37℃吸附1h，弃去标本液，换上细胞维持液，置37℃孵育至出现细胞病变，按照上述方法在细胞内连续传代三次。用特异免疫血清作中和试验进行鉴
定。肠腺 病毒4041型感染Grahm293细胞12天后，细胞出现特征性病变，细胞肿胀变圆，
成堆呈葡萄 状。在传代培养第二代时10天左右出现局灶性病变，15天后病变完全。
A9 隐孢子虫检验 人体隐孢子虫病的病原诊断并不困难，主要是从粪便，呕吐物和痰等中找到卵囊即可确
诊。检查卵囊 的方法很多，但多认为急性隐孢子虫病人粪便中卵囊数量多，检查时无需浓集，
粪便直接涂片后再用特异 的染色方法检查，容易发现卵囊。如果检查与病人或病畜接触过的
人群，复查治疗后的病人等，采用浓集 法可提高检出率。检查此类人群与环境、水中的隐孢
子虫污染情况还可采用免疫学和分子生物学检测方法 。
A9.1标本制备：粪便直接涂成2分硬币大小的粪膜（厚于或接近常规涂片），在自然或
37℃下使之充分干燥后，滴加甲醇固定5min，或通过火燃固定后待染色。
A9.2金胺—酚染色法
A9.2.1试剂配制：0.1%金胺—酚染色液（第一液）：金胺 0.1g，石炭酸5g，蒸镏水100ml，
充分溶解，3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95% 酒精100ml；0.5%高锰酸钾液（第三液）：
高锰酸钾0.5g，蒸镏水100ml。
A9.2. 染色步骤：滴加第一液于粪膜上，5～10min后水洗；滴加第二液，1min后水洗；
滴加第三液，1min后水洗，充分干后荧光镜低倍过筛检查，高倍判断结果。
注：染色所用的金胺—酚和高锰酸钾溶液配制后，不宜超过一个月，否则影响染色结果。
A9.2.3 结果判定: 染色后的标本在荧光镜低倍下卵囊为一圆形亮点，高倍下发出乳白色
或略带绿色的荧光，多数卵囊周围深染，中央淡染，似厚环状，或深色结构偏位，有些全为
深染。卵囊 多时似繁星，即使不再用其它方法染色亦可判断。但有的标本可出现非特异的荧
光颗粒，应注意鉴别，特 别注意与圆孢子虫卵囊的鉴别，圆孢子虫卵囊（7～8μm）比微小
隐孢子虫卵囊大，荧光着色偏暗，内 含暗色颗料状物，或呈不规则的筛网状。本法简便、敏
感，适用于批量过筛检查。
A9.3改良抗酸染色法
A9.3.1试剂配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4 g，95%酒精20ml，石炭酸
8ml，蒸镏水100ml；3%盐酸酒精（第二液）：ml，95% 酒精100ml；2%孔雀绿原液：孔雀
绿2g，蒸镏水100ml。1：10孔雀绿工作液（第三液） ：孔雀绿原液1ml，蒸镏水10ml
A9.3.2染色步骤：粪便涂片和固定方法同前。滴加第一液 于粪膜上，1.5～5min后水洗；
滴加第二液，1～3min后水洗；滴加第三液，1min后水洗 ；干后光镜油镜观察。
A9.3.3结果判定：粪便涂片经本法染色后，卵囊为玫瑰色，背景为蓝绿色 ，对比性很
强。卵囊圆或椭圆形，大小5.0×4.5μm，发亮，因观察的角度不同，囊内子孢子排列 似不
规则，呈多形态状，残余体为暗黑（棕）色颗粒状。经该法染色的标本大多存在许多非特异
的抗酸红色颗粒（婴儿的粪便中没有或很少），大小不等，染色均匀一致，不发亮，内部无
结构。此外， 圆孢子虫卵囊用该法染色后不发亮，呈淡红或深红，内含大小不等的暗黑色颗
粒，分布不均匀，有的卵囊 不着色，只见暗色颗粒状物。观察时应注意区别。
A10 蓝氏贾第鞭毛虫的检验
A10.1 标本的收集
A10.1.1 粪便标本的收集：按常规进行。
A10.1.2 十二指肠抽出液：用作胆道感染的诊断，也可提高肠道感染的检出率。
A10.1·3 血清：检查其中的特异性抗体，可提高肠道感染的检出率。
A10.2 实验诊断
A10.2.1 病原学检查：是目前贾第虫病确诊的依据。贾第虫在发育过程中有滋养体和
包囊2期。贾第虫病患者的水样稀便多为滋养体阳性,而糊状或块状粪便可能仅含有包囊。
A10.2.1.1 滋养体的检查：滋养体在腹泻病人的粪便和十二指肠液中。标本先以500×
g 离心10min ,取 沉淀用生理盐水涂片,用光学显微镜检查。形态从正面观呈倒置纵切梨性，
前端钝圆，后端尖细，大小为 （12～15）μm×（6～8）μm，厚2～4μm。侧面观呈瓢状，
背面隆起，腹部内陷形成吸盘。 在新鲜标本，虫体靠鞭毛摆动很活泼。由于滋养体只存在于
新鲜的水样标本中,且分解快,故检测滋养体 ，操作要迅速。
A10.2.1.2 包囊的检查：包囊出现在成形粪便或十二指肠液中，可用碘液（ 2%）染色
法、乙醚乙醛沉淀法和硫酸锌离心浮聚法检查。包囊的形成呈间歇性，宜隔天检查，连续3< br>天。包囊呈椭圆形，大小为（8～12）μm×（11～10）μm。囊壁与虫体之间有明显的不均
匀空隙，成熟包囊内有4个核。
A10.2.1.3 Trichrom 染色(三原染色)： 三 原染色既可用新鲜粪便,也可用PVB固定的粪
便。在固定和染色理想的标本中,背景是蓝绿色,虫体的 细胞质和染色质呈紫红色。新鲜样本
观察到的包囊呈现典型的卵(椭) 圆形，一般长11～14μm ，成熟的包囊可看到有四个核,
未成熟的包囊有两个核；而滋养体则为梨形。Trichrom 染色后 看到的滋养体呈典型梨状，
有两个泡状核，位于轴柱的两侧,核内各有一个大核仁，四周有空隙，使并列 的双核构成独
特的梨形，而鞭毛则极少在染色的标本中出现。
A10.2.2免疫学检测
A10.2.2.1 直接免疫荧光抗体法(DFB): 用荧光标记贾第虫的单克隆抗体,检测粪便中的
包囊囊壁抗原。
A10.2.2.2 酶免吸附法( ELISB):运用双抗体夹心法,在载体上(如微孔板、硝酸纤维素膜
等) 包被贾第 虫的多抗和单抗,并用配对的单抗或多抗做酶或染料标记,主要检测粪便中的
贾第虫包囊囊壁抗原。
国外已有多种免疫学检测贾第虫包囊囊壁抗原的商品试剂盒面世.
A10.2.2.3血清学 检查：可使用间接血凝试验，间接荧光抗体试验或ELISA等方法。用以
检测人血清中的贾第虫特异性 抗体。IgM抗体对近期感染的诊断意义较大。
A10.2.3 分子生物学技术
PCR作 为一种贾第虫的诊断技术目前仍处于试验阶段,无商品试剂盒。引物多选择贾第虫
的贾第虫素基因、hs p基因和 SSUrRNA。PCR 作为检测诊断技术,在水源、环境、食品的监测
中前景广阔。

附录B
（资料性附录）
常见感染性腹泻病的主要特征

B1 沙门菌肠炎
沙门菌肠炎包括除伤寒及副伤寒甲、乙、丙型以外的所有沙门菌感染。沙门 菌为革兰
氏阴性短小杆菌,无荚膜，有动力，抗原结构复杂。在水、牛乳或肉类食品中能存活一年以上，加热60℃ 30min可灭活，对含0.3～0.5mgL余氯的氯化消毒饮用水及酚、阳光等敏感。
传染源为病人、带菌者、患病及带菌动物。以食源性和医源性传播为主，也可通过水源、接
触传 播。人群普遍易感，幼儿（尤其1岁以内）为甚。全年均可发病，夏秋季多发。沙门菌
感染可呈胃肠型、 伤寒型和败血型。胃肠型潜伏期多为6～24h，急性起病，伴恶心、呕吐、
腹痛、腹泻。婴幼儿较易发 生脱水和电解质紊乱。粪便多为黄色或绿色稀水便，亦可带有粘
液和血，粪便镜检可见较多的白细胞及红 细胞，并可见巨噬细胞。
B2 肠致泻性大肠杆菌肠炎
大肠杆菌是革兰阴性杆菌，无芽胞 ，多有鞭毛。主要抗原为O、H、K抗原。引起感染
性腹泻的有5个病原群：肠致病性大肠杆菌(EPE C)、肠产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭
性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌产志贺 毒素大肠杆菌(EHECVTEC)、肠集聚性粘附大
肠杆菌（EAggEC）。该菌对热的抵抗力较其 它肠道杆菌强，55℃60min或60℃15min仍有部
分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至 数月，在温度较低的粪便中存活更久。
肠致病性大肠杆菌(EPEC)的传染源主要是病人及带菌者，以粪-口途径为主要传播方
式， 人群普遍易感，但以幼儿多见，5～6月为发病高峰。轻症者不发热，大便每日3～10
余次黄色蛋花样 便，量较多；重症患者可有发热、呕吐、腹痛、腹胀，呈粘液便，呕吐、腹
泻严重者可有失水、酸中毒表 现。成人常急性起病，脐周腹痛伴痢疾样大便。粪便镜检可见
少许红、白细胞，偶可满视野，并有大量脂 肪颗粒。
肠产肠毒素性大肠杆菌(ETEC) 病人和带菌者为主要传染源，主要通过被污染的水体 、
食品、牛奶、饮料等传播，可散发或暴发流行，多表现为“旅游者腹泻”或食物中毒。人群
对 ETEC普遍易感，成人、小儿均可发病。潜伏期一般为0.5～7 天。症状表现为分泌性腹泻，
大便 呈水样。伴有腹部痉挛、恶心、呕吐、头痛、肌痛，很少发热。病情轻重不等,有的仅
有轻微腹泻,有的 呈重症霍乱样,重度脱水，酸中毒，甚至死亡。
肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)

可通过污染的水和食物引起暴发或流行,也可因接触传播
形成散发病例；成人、儿童均可发病。临床表现 与菌痢相似，临床上表现为发热、腹痛、腹
泻、里急后重、脓血便。
肠出血性大肠杆菌产志贺毒素大肠杆菌(EHECVTEC) 家禽和家畜为其贮存宿主和
主要传染源，病人和无症状携带者也是传染源之一；经消化道以及接触传播；人群普遍易感，
但以老人、 儿童为主；季节性明显，7～9月为流行高峰。主要临床表现为突发腹部痉挛性
疼痛、不适，初为水样便 ，继之转为鲜血性粪便、不发热或低热，可伴恶心、呕吐及上感样
症状。大便镜检几无炎症渗出性细胞。 多数病人表现为自限性疾病；少数病人可继发急性溶
血性尿毒综合征(HUS)以及血栓性血小板减少性 紫癜。
肠集聚性粘附大肠杆菌（EAggEC）主要与小儿顽固性腹泻有关，症状可持续两周或以
上。
B3 致泻性弧菌肠炎
本标准中致泻性弧菌包括副溶血弧菌、河弧菌、拟态弧菌、霍利斯弧菌 等。副溶血弧菌
为革兰染色阴性、无芽胞、具有鞭毛，呈杆状或稍弯曲样，形态多变性，嗜盐生长。氧化 酶
阳性，不发酵蔗糖。临床分离株大多神奈川试验阳性，环境分离株一般为阴性。耐碱畏酸，
对 热敏感，56℃3min死亡，一般消毒剂敏感。本病传染来源为带菌的海产品，近海淡水鱼带
菌较高。 患者为传染源。本菌主要通过食物传播；各年龄均易感，以青壮年居多；7～9月为
发病高峰。本病潜伏 期2h至4天，平均15h。起病急骤，腹泻、腹痛、恶心、呕吐、发热，重
症可脱水，循环衰竭，少数 有中毒性休克。粪便呈水样、血水便或脓血便，镜检可见白细胞
和脓细胞，常伴有红细胞，亦可见巨噬细 胞。
B4弯曲菌肠炎
弯曲菌为微需氧，革兰染色阴性，多形态性，无芽胞，引起人类腹泻的 主要是空肠弯曲
菌、结肠弯曲菌。空肠弯曲菌感染后肠道产生局部免疫，血中也产生抗O的IgG、Ig M、IgA
抗体，有一定保护力，该菌抵抗力不强，对热敏感，60℃5min即可灭活，对物理和化学 消
毒剂均敏感。本病为人畜共患病，主要传染源是家禽、家畜和鸟类，急性期患者和带菌者可
为 传染源。主要经食物和水传播，也可接触传播。人群普遍易感。全年均可发病，夏秋季多
发。平均潜伏期 3～5天，主要症状为发热、腹泻、腹痛，少数伴有呕吐；粪便呈黄色水样
便，部分为粘液便和脓血便。 典型者脐周呈痉挛性绞痛。粪便镜检可见白细胞或多量红细胞
及脓细胞。
B5 小肠结肠炎耶尔森菌肠炎
为人畜共患疾病，系由小肠结肠炎耶尔森菌引起。该菌为嗜冷菌，革兰阴性无 芽胞杆菌。
可在-2℃～45℃生长。对湿热和化学消毒剂敏感。本病传染源为患者、带菌者、患病和带 菌
动物。多为消化道传染。人普遍易感。全年均可发病，以秋、冬、春季较多。潜伏期4～10
日。主要表现为突然发热，腹痛和腹泻，部分可有类似于阑尾炎症状、慢性反应性关节炎及
结节性红斑以 及败血症、突眼性甲状腺肿等。粪便呈水样稀便，可带粘液，偶带脓血，镜检
可见白细胞、红细胞。
B6 轮状病毒肠炎
人轮状病毒属于呼肠病毒科，基因组为11个片段的双股线型RNA，直 径约为70～
75nm，呈球形，有双层衣壳，从内向外呈放射状排列，电镜下完整颗粒如车轮状。根据 内
层衣壳多肽构成的组特异性抗原，可分为A～G七组，其中A、B、C组和人类疾病有关。外
膜壳蛋白（病毒结构蛋白：VP）VP4和VP7是其主要中和抗原，能刺激机体产生相应抗体。
VP4 中和抗体的作用很弱，且有一定的交叉，而VP7中和抗体对机体有保护作用。病毒在外
界环境中比较稳 定在室温中可存活数月，耐酸、耐碱，55℃30min可使其灭活。本病传染源
为患者和无症状携带者 ；传播途径主要经粪-口途径传播，也可经接触和呼吸道传播；人群
均易感。A和C组主要感染儿童，以 秋冬季节多见；潜伏期2～3天，主要症状为腹泻和呕吐，
可伴发热和或呼吸道症状，严重者常伴有脱水 及代谢性中毒，常并发肺炎、心肌炎、脑炎
及病毒血症；大便为水样便或黄绿色稀便，无粘液、无脓血。 B组主要感染成人，常于5～
6月短期暴发流行；潜伏期2～3天，以腹泻为主，伴恶心、呕吐、腹痛、 乏力等症状。大便
多为黄色水样便，无粘液及脓血。镜检多无异常，少数可见少量白细胞。
B7 诺瓦克病毒肠炎
诺瓦克病毒属于嵌杯病毒科，诺瓦克样病毒属，为单正链RNA病毒，无包膜，直径25 ～
3 5nm,电镜下呈圆球状或多面状。有很强的耐乙醚、耐酸及耐热能力。传染源是病毒感染者
和患者，主 要是患者；粪-口传播途径为主，散发病例为人-人接触感染，暴发流行常由食物
和水的污染造成；全年 均可发病，但以秋冬多见；主要侵袭成人和大龄儿童。潜伏期24～48h，
主要表现为腹泻、腹痛、恶 心、呕吐，可伴有低热、头痛、肌痛、乏力、及食欲减退；腹泻
为黄色稀水便，无脓血和粘液；镜检可见 白细胞或脂肪滴。
B8 肠腺病毒肠炎
腺病毒为无包膜的双股DNA病毒，至少分为47个 血清型，其中40型和41型即肠腺病毒。
病毒颗粒呈球形，直径70～90nm，病毒体呈类似通讯卫 星样结构。腺病毒对酸碱及温度的
耐受范围较宽，对脂溶剂有较强的抵抗力，紫外线照射30min或5 6℃30min可被灭活。传染
源为患者和隐性感染者；可经接触、粪-口途径及和呼吸道传播；婴幼儿 多发；无明显季节
性，秋冬季节多发；以散发和地方性流行为主。潜伏期3～10天。临床症状以腹泻为 主，可
伴呕吐、发热，亦可有呼吸道感染症状。粪便呈水样便或稀水便，少数可有粘液；镜检无脓
细胞及红细胞，可有少量白细胞。
B9 隐孢子虫病
隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的人兽 共患寄生虫病。隐孢子虫是一种专性细胞内生长的
机会致病寄生原虫。隐孢子虫生活史包括卵囊、子孢子 、滋养体、裂殖体、雌雄配子体及合
子等阶段，仅需单一宿主即可完成，整个生活史约5～15天完成。 目前至少已发现的6种隐
孢子虫中，感染人和哺乳动物的主要是微小隐孢子虫。虫卵囊对多种常用消毒剂 和化学品有
较强的抵抗力，在湿冷的环境下可存活数月或1年左右。感染隐孢子虫的动物和人以及无症< br>状带虫者为传播本病的主要传染源。传播方式以粪-口，手-口途径为主。感染与职业及免疫
功能 状态有关。农民、兽医及实验室工作人员多发。全年均可发病，但温暖、潮湿夏秋季节
多见。平均潜伏期 7天。临床主要表现为腹泻、腹痛、恶心、呕吐、厌食、乏力及体重下降
等，可伴有低热。免疫功能缺陷 者，尤其是艾滋病患者,缓慢起病，腹泻持续。大便可呈水
样便或粘液便，无脓血，可有恶臭，粪镜检可 见白细胞或脓细胞。在免疫功能缺损患者中，
偶有发生呼吸道感染等肠外表现，胆道感染亦有发现。
B10 蓝氏贾第鞭毛虫肠炎