动物肝脏DNA提取

2020年12月16日发(作者：元俊)

实验教学教案首页

本次实验项目：

本次实验课时：10学时
实验类型：综合性

动物肝脏DNA的提取及检测
教学要求：
1．掌握实验原理
2．知道提取DNA要去除的物质，各步操作要规范，能够提取出DNA。
3．掌握琼脂糖凝胶电泳的实验操作技术

重 点：各步操作要规范，能够提取出DNA。能够用电泳方法检测出所提的DNA。

教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。


讲授内容及时间分配：

课堂讲授
1．相关知识…………………………………………………………… …… 0.1 学时
2．实验目的………………………………………………………………… … 0.3学时
3．实验原理…………………………………………………………………… 0.3 学时
4．实验操作 …………………………………………………… … 0.3 学时

实验教学
动物肝脏DNA的提取及检测实验的操作技术……………………… …… 9 学时







参考资料

《分子生物学实验》

综合性、设计性实验基本信息表
学院名称
课程名称
实验名称
实验性质
（√）

实验目的：
根据教师提供的实验条件，了解并 掌握提取基因组DNA的原理和技术。能够从动物
肝脏中提取DNA粗品，并能够用琼脂糖凝胶电泳法检 测所提DNA。对实验结果做出正确
定的分析。

生物科学与工程学院
生物化学
实验室名称
面向专业
生物化学实验室
生物科学、生物技术

大纲规定
学时数
动物肝脏中DNA的提取及检测
□
综合性
√

□
设计性
10
10 实开学时数
实验要求：
实
验
性
质
及
依
1． 根据教师给准备的实验材料、实验仪器和试剂，结合实验目的进行整个实验过程
在实验前做好预习；
2． 做好每步实验结果的记录，根据原始记录，对实验结果做出正确分析，写好实验
报告；
写出本实验成功与失败的原因。
实验内容：
第一部分：动物肝脏中DNA的提取
第二部分：DNA琼脂糖凝胶电泳
据
认定依据：
本实验内容所涉及本课程综合知识包括以下几方面：

1. 蛋白质变性作用、变性剂和酶的抑制剂。
2. 细胞膜蛋白的裂解、核蛋白体的解离。
3. EDTA、SDS、蛋白酶K的作用。
4．DNA的理化性质、DNA片段的大小表示方法、DNA与染料分子EB的结合。
5. 琼脂糖凝胶浓度的选择及配制。
6．电泳知识及影响电泳样品迁移率的因素。

实验项目设计人签字：李敏 2007年5 月10 日
专家组认定意见
专家组组长： 年 月 日
学

院

意

见
盖章 年 月 日
职
能
部
门
意
见



盖章 年 月 日

动物肝脏DNA的提取及检测
（综合性）

相关知识
1．蛋白质变性作用，变性剂和酶的抑制剂
2．EDTA、SDS、蛋白酶K的作用、DNA的理化性质：溶解特性
３．影响电泳迁移率的因素
４．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度
0.3 0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-4
2.0
0.1-3
线状DNA大小kb
5-60
５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。
６．琼脂糖凝胶电泳的特点

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组
成。琼脂糖是由半乳糖及 其衍生物构成的中性物质，
不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸
性多糖，由于这些 基团带有电荷，在电场作用下能
产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质
作用而影响电 泳速度及分离效果。因此，目前多用
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。
②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由 电
流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。
７．常用染料EB（溴化乙锭Ethidium Bromide，EB）：
溴乙锭染料全名 是3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，是诱变剂，可与核酸结合，在紫
外光下呈黄色荧光。 使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。

①在300nm波长的紫外光照射下 发出荧光。在适当的下，荧光强度与DNA片段的大小(或
数量)成正比。
可插入碱基与碱基之间造成移码突变。

DNA（RNA）定量 分析：可用紫外光谱
分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处
有特异的紫外吸收峰 ，且吸收强度与
DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼
脂糖凝胶电泳上显示的DN A（RNA）带的亮
度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插
入DNA(RNA)的碱基 对平面之间而结合于其
上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子 的长度和数量成正比。
在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分 子量及浓度的参考，样品
DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示DNA（RNA）量的多少。

８．提纯的思路
①基因组DNA的特性：分子量较大、所提取的DNA片段的大小：100 — 150kb，易断（如何
保证DNA分子的完整性？）
②组织和细胞的破碎
③要去除的物质
：
蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
第一部分 动物肝脏DNA的提取
一、实验目的
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和技术。
二、实验原理
在EDTA 和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动
物基因组DNA，用此 方法得到的DNA长度为100－150Kb，适用于Southern杂交、基因组DNA
文库的构建 ，酸性条件下DNA溶于有机相。碱性条件下（7~8以上）溶于水相。
三、实验仪器、材料和试剂
材料：鸡肝
试剂：
1．5molL Nacl
2． 0.5 molL pH8.0
3． 0.5 molL EDTA pH8.0
4． 3molL NaAc pH5.2
以上均高压灭菌
5． 蛋白酶K：10mgml配好后用一次性过滤器过滤，－20度保存
6． 组织匀浆液 100mmolL NaCl, 10mmolL （pH8.0），25mmolL EDTA （pH8.0）
7． 酶解液：200mmolL NaCl, 20mmolL （pH8.0），50mmolL EDTA （pH8.0），
200ugml蛋白酶K，1%SDS。
8． 无DNA酶的RNA酶：将胰RNA酶溶于100 mmolL （pH7.5）、15 mmolL NaCl
溶液中，浓度10mgml，于100度水浴处理15分钟以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，
－20度保存。
9． TE缓冲液 10mmolL （pH8.0），1 mmolL EDTA（pH8.0）
10． 平衡酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇＝25：24：1（体积比）
10. 氯仿：异戊醇＝24：1（体积比）
11. 5×TBE 5.4gTris, 2.75g硼酸，2ml 0.5 molL EDTA （pH8.0），加水到100ml
12. 6×上样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40%（WV）蔗糖水溶液
13. DNA相对分子质量标准片段（bp）。
四、实验操作步骤

0.3g（0.2g）鸡肝，（冰冷生理盐水洗3次），剪碎(速度要快)


碎鸡肝转入预冷的玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液（含EDTA），匀浆
（低温操作，至少5－6次，直到无大块的组织存在）


匀浆液转入2mL小离心管（转管前先静置一会，防止未碎的大块的组织进入2ml管）

0
4C , 5000rpm离心1~2min（离心要平衡，对称）


弃上清，沉淀（细胞）加0.4mL无菌水，用枪吹散，再加0.4mL酶解液（含SDS、蛋白酶K）
慢慢颠倒混匀，

55℃ 水浴酶解2-3小时，直到酶解液彻底清澈

（加RNase ,终浓度200ugmL，37
0
C保温60min,可省略）


加等体积酚氯仿，（取下层液）慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min

4C，10000rpm离心10min


0
试管中液体分三层：水相、蛋白层、有机相

用钝化枪头小心取出上清水相（水相中含有DNA丝状粘稠）入另一新1.5小试管中
注意不要取到蛋白


上清加110体积的3molL NaAc（pH5.2 ？）和2倍体积的无水乙醇

慢慢混匀，冰上（-20℃）静置30min以上（析出DNA，观察丝状物）


4C，8000rpm离心10min


沉淀用1mL 70%冷乙醇洗1-2次，每次8000rpm离心10min，弃上清


离心管中开盖，超净台中干燥沉淀

0
加 20-100uL TE, 4C溶解（可根据沉淀量确定加TE的量）


问题：各步操作所用试剂的作用及结果现象？操作方法注意事项？
0

第二部分 DNA琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理

DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在
P
H3.5时， 整
个分子带正电；
P
H8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下 ，不同的核酸
分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，相同碱基数量的双链DNA 几乎
具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即DNA分本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA
片 段泳动速度不一样，可进行分离。
三、仪器、材料与试剂
（一） 仪器
电泳仪 、平板电泳槽、样品槽模板（梳子）、橡皮膏、锥形瓶（100ml或50ml）、紫外分析
仪、照相机 或凝胶自动成像仪、一次性塑料手套、Eppendorf管（1.5ul）、微量移液器、量筒、
微波 炉。
（二）材料 自已提取的DNA，相对分子质量标准品
（三）试剂
1．5× TBE储液(
P
H8.0) 每升含Tris54g，硼酸27.5g，0.5molL EDTA20ml，使用时稀释 10
倍成0.5×TBE（1×TBE也可）。
2．6×凝胶加样缓冲液 0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10molL NaOH 1~2滴，调至蓝色。
３．10mgml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成0.5ugml的EB。
四、实验操作步骤
1．
琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提DNA的大小来确定 ，0.8%）配0.8%的胶，称到一定
量的琼脂糖，放入锥形瓶中，加入25ml 0.5×TBE缓 冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化取
出摇匀，得一定浓度。等琼脂糖凝胶溶液冷却至50℃。加入E B液（3ul，原液10mgml）。
2.凝胶板的制备
3．加样（样品总体积在10~30ul）
待测DNA中和DNA标准样品中分别加入15体积的溴酚蓝指示剂，混匀用移液器加入加样孔。
4.电泳
电压选择为80~120cm，溴酚蓝移动到距胶板正极端约 1cm时停止电泳。
5.结果观察 在254nm紫外光灯下（300nm紫外灯下）

五、实验结果与讨论

1．根据观察结果，按比例绘出凝胶图谱，并注明观察到的DNA亮带。
2．判断所提DNA是否完整，如果断裂或者弥散，分析是在哪些步骤出现的问题。
3. 提DNA及电泳过程都遇到哪些问题，有哪些是在操作中应该注意的。
六、注意事项

思考题
1.各步骤及所加试剂的作用及结果现象
2
．核酸的变性？核酸的理化性质