消化道酶活力

2020年12月14日发(作者：石英)
第四章 牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度
对消化酶活力的影响

牛蛙(Rana catesbeinana)隶属两栖纲无尾目蛙科，其肉质细嫩，味道鲜美，
营养丰富，是有名的肉用型蛙类。牛蛙具繁殖快、适应性强、生长迅速和抗
逆性强等优点，且其养殖饲 料易取。在我国，牛蛙的人工养殖得到了大规模
推广
[1]
。
研究消化酶的 活力及其影响因素可了解动物对食物不同成分的消化
能力，为动物天然饲料的选择、优质人工饲料的配制 和适宜养殖条件的确
立提供理论基础，对提高动物养殖的经济效益无疑是有帮助的。目前，对
低 等脊椎动物消化酶的研究主要集中在经济养殖型鱼类
[2-9]
和爬行类
[10]，对
两栖类消化酶的研究报道较少
[11-14]
。奚刚等
[14]对牛蛙幼体发育阶段消化道
蛋白酶和淀粉酶的活力变化情况进行了研究。有关成体牛蛙消化系统消化
酶分布情况及各种理化因子对牛蛙消化酶活力的影响方面的研究尚未见
报道。pH和温度是影响 牛蛙生活的重要环境因子，其可通过影响消化酶活
力直接影响牛蛙对食物的消化吸收能力，并最终影响牛 蛙的生长发育。本
文在检测牛蛙消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分布情况的基
础上 ，对pH和温度对牛蛙消化酶活力的影响进行了研究，旨在增进对牛蛙
消化生理特点的认识，为牛蛙人工 养殖中环境因子的控制和饲料营养成分
的合理搭配提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
鲜活的成体牛蛙购自芜湖市黄山西路菜市场，重250~300 g。将牛蛙
毁髓处死，剖腹，迅速取出胰脏和完整消化道。将消化道剪开，用4℃ 预
冷的0.65 %的生理盐水快速洗净，按食道、胃、前肠、中肠和后肠(直肠)
取材，用吸水纸轻轻吸干，称重。
1.2 酶液的制备
根据所称得的消化系统各部分的质量，加入20倍质量的4 ℃蒸馏水，
在冰水浴中充分匀浆，捣成糜状，以2000 rmin的速度冷冻离心15 min，
取上清液即为酶液。保存于4℃冰箱中，8 h内分析完毕。
1.3 消化酶活力的测定
1.3.1 蛋白酶活力的测定 采用福林- 酚试剂法
[11]
，略有改动。取0.5 mL 1 %
的酪蛋白溶液于试管中，分别加入不同pH值的缓冲液2 mL，混匀，30 ℃
水浴预热5 min。在反应管中按食道、胃、前肠、中肠、后肠和胰脏顺序
分别加入0.25 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.5 mL、0.5 mL和0.5 mL预热的粗
酶液。恒温水浴锅控制反应温度，充分反应15 min。立即加入1.5 mL 10 %
的三氯乙酸终止反应，静置15 min。对照管在加入10 %三氯乙酸后再加酶
液。过滤，取滤液1 mL，加0.55 molL的Na
2
CO
3
5 mL，福林-酚试剂1 mL，
摇匀。在30 ℃水浴中显色15 min。用7200型分光光度计，680 nm 波长
条件下测光吸收值。以30 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸作为1
个酶活力单位(U)。
1.3.2 脂肪酶活力的测定 采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法
[4]
。取缓冲液
2.5 mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液2 mL于锥形瓶中，30 ℃保温5 min，然
后在锥形瓶中加入1.0 mL酶液，30 ℃下反应30 min后立即加入95 ％乙
醇5.0 mL终止反应，再加3滴酚酞，用0.05 molL氢氧化钠滴定，对照组
在加入95 ％乙醇后再加酶液，其余与实验组相同。以30 ℃下每分钟作用
于聚乙烯醇橄榄油乳化液产生的脂肪酸最后消耗1 mL 0.05 molL的NaOH
为1个酶活力单位（U）。
1.3.3 淀粉酶活力的测定
采用3,5-
二硝基水杨酸比色法
[4]
，略有改动。
取0.665 mL预测粗酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液0.665
mL，混匀，将反应组置于30 ℃恒温水浴锅中预热5~10 min，同时对照组
在100 ℃沸水中煮5~10 min（使酶失活）。再向反应组和对照组试管中加
入已预热的1 %的淀粉溶液0.67 mL，摇匀，于30 ℃水浴反应20 min后再
加入2 mL的3,5-二硝基水杨酸，摇匀。立即放入100 ℃沸水中显色5 min，
使酶失活并终止反应，流水冷却后稀释10倍，用7200型分光光度计，490
nm波长条件下比色，测光吸收值。以30 ℃下每分钟水解淀粉产生1 mg
麦芽糖作为一个酶活力单位（U）。
1.3.4 纤维素酶活力测定 采用羧甲基纤维素钠水解法
[4]
。取1.0 mL酶液
于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液3.0 mL，0.5 %羧甲基纤维素钠
溶液0.8 mL，蒸馏水0.6 mL，混匀40 ℃水浴糖化30 min，取出立即置于
沸水浴15 min，对照组先置于沸水浴中使酶失活，其余步骤相同。取0.5 mL
糖化液加3,5-二硝基水杨酸1.5 mL，沸水浴15 min，冷却，加蒸馏水3 mL，
用7200型分光光度计，于550 nm处测吸光值。以40 ℃每分钟催化纤维
素生成1.0 μg葡萄糖为一个酶活力单位（U）。
1.4 pH梯度的设置
利用不同pH值的缓冲液来调节反应的pH条件。实验中共使用4种缓
冲液，以KCl- HCl配制pH 0.5-1.5的缓冲液，以Na
2
HPO
4
-柠檬酸配制pH
2.2-8.0的缓冲液，以巴比妥钠-盐酸配制pH 8.0-~9.6的缓冲液，以甘氨酸-
氢氧化钠配制pH 10.0-10.6的缓冲液。胃消化酶的 pH值范围为1.0、1.5、
2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，共9个p H值梯度。肠和胰脏消化酶
的pH值范围为4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0 、9.6和10.0，共9个
pH值梯度。
1.5 温度梯度的设置
设置15 ℃、20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃
和60 ℃共 10个温度梯度，根据上面所测胃、肠和胰脏各自的最适pH值，
选择对应的缓冲液按上述方法分别测定 胃、肠和胰脏在不同温度条件下的
消化酶活力。
1.6 数据处理
实验数据取3次测量的平均值（
著。
±SD），用单因素方差分析(one-way
ANOVA)对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较，P<0.05为差异显
2 结果
2.1 牛蛙消化酶的分布
牛蛙消化系统不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力见表1。由 表
4-1可知，牛蛙消化系统三种消化酶的活力均以胰脏最高，显著高于其它
部位（P<0.0 5）。在消化道中，蛋白酶活力以胃最高，显著高于食道和肠道
（P<0.05）。肠道各段间、肠道各 段和食道间蛋白酶活力差异不显著
（P>0.05）。脂肪酶活力在消化道各段由前至后逐渐增加，肠道 脂肪酶活力
显著高于胃和食道（P<0.05），其中后肠脂肪酶活力显著高于前肠和中肠
（P <0.05），胃和食道间脂肪酶活力大小差异不显著（P>0.05）。淀粉酶活
力主要分布于肠道， 肠道各段淀粉酶活力显著高于胃和食道（P<0.05），肠
道各段间淀粉酶活力差异不显著（P>0. 05）。食道和胃淀粉酶活力大小相当，
差异不显著（P>0.05）。我们还对牛蛙消化道纤维素酶的 活力进行了检测，
结果未观察到明显的酶活力。
表4-1 牛蛙消化酶分布
n=3;

蛋白酶活力
Activity of
protease
脂肪酶活力
Activity of lipase
淀粉酶活力
Activity of
amylase

食道
esophagus
14.5
b
±2.5
0.14
d
±0.01
0.14
c
±0.01
胃
stomach
116.6
a
±17.3
0.18
d
±0.02
0.17
c
±0.02
前肠
foregut
7.98
b
±4.7
0.27
c
±0.02
1.02
b
±0.09
中肠
midgut
24.7
b
±8.0
0.29
c
±0.05
1.12
b
±0.08
±SD; Unit: Ug
胰脏
pancreas
118.6
a
±24.3
3.67
a
±0.10
3.34
a
±0.05
后肠
hindgut
3.63
b
±1.6
0.36
b
±0.07
1.05
b
±0.04
注：上标不同的平均值间差异显著，a > b > c > d（P < 0.05）
2.2 pH对消化酶活力的影响
2.2.1 pH对蛋白酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏
蛋白酶的活力变化情况见图1。由 图4-1可知，三个部位蛋白酶活力与pH
关系均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和9.6 。胃蛋白酶在pH值1.5-2.2
范围内显示较强的活力，pH值为2.2时最高，pH值大于2.2 后胃蛋白酶的
活力急剧下降，pH值为6.0时酶活力只有最大活力的5.0 %左右。肠蛋白
酶活力在pH值4.0-6.0范围内变化较平缓，在pH值6.0-7.4范围内随pH
值的升高而快 速升高，在pH值7.4时达到最大值，pH值继续增大时酶活
力逐步下降。胰蛋白酶活力在pH值大于 4.0时迅速增加，pH值为9.6时
达最大值，pH值为10.0时胰蛋白酶活力又迅速下降。
250
200
150
胃 Stomach
肠 Intestine ×10
胰 Pancreas
蛋
白
酶
活
力
(
U

g
)
A
c
t
i
v
i
t
y

o
f

p
r
o
t
e
a
s
e
100
50
0
11
pH值 pH value

图4-1 pH对蛋白酶活力的影响

2.2.2 pH对脂肪酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏
脂肪酶的活力变化情况见图4-2 。由图4-2可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活
力与pH关系曲线均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、 7.4和8.0。胃脂肪
酶活力在pH值1.5-2.2范围内上升较快，pH值为2.2时达最大值， pH值
大于3.0后胃脂肪酶的活力又不断下降，pH值为7.4时酶活力只有最大活
力的17 .0 %左右。肠道脂肪酶活力在pH值为5.0-7.4范围内迅速上升，在
pH值为7.4时达到最 大值，而后又迅速下降；胰脂肪酶活力在pH值小于
7.0时变化较平缓，pH值大于7.0时急剧上升 ，pH值为8.0时酶活力达最
大值，而后迅速下降。
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
11
胃 Stomach
肠 Intestine
胰 Pancreas 10
脂
肪
酶
活
力
(
U

g
)
A
c
t
i
v
i
t
y

o
f

l
i
p
a
s
e
pH值 pH value

图4-2 pH对脂肪酶活力的影响

2.2.3 pH对淀粉酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏
蛋白酶的活力变化情况见图4-3。由图4-3可知，胃、肠道 和胰脏淀粉酶的
最适pH值分别为7.0、8.0和9.6。胃淀粉酶活力与pH关系曲线呈双峰型，< br>pH值对淀粉酶活力影响很大。当pH值为2.2时有一个较小的峰值，接着
在pH值值为7.0 时又有一个较大的峰值，且此时酶的活力大约是pH为2.2
时的4-5倍。肠道和胰脏淀粉酶活力与 pH的关系曲线均呈单峰型。在pH
值小于7.0时，肠淀粉酶活力变化较平缓，pH值大于7.0时酶 活力急剧上
升，到pH值为8.0时达最大值，pH值继续升高时酶活力又急剧下降。胰
淀粉酶 活力在pH值大于5.0时上升较快，pH值为9.6时达最大值，然后
随pH值升高酶活力又急剧下降 。


2.0
胃 Stomach
肠 Intestine
胰 Pancreas 10
淀
粉
酶
活
力
(
U

g
)
A
c
t
i
v
i
t
y

o
f

a
m
y
l
a
s
e
1.5
1.0
0.5
0.011
pH值 pH value

图4-3 pH对淀粉酶活力的影响

2.3 温度对消化酶活力的影响
2.3.1 温度对蛋白酶活力的影响 不同 温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏蛋
白酶的活力变化情况见图4-4。由图4-4可知，胃、肠和胰脏蛋白 酶活力与
温度的关系曲线均呈单峰型，最适温度分别为45 ℃、50 ℃和45 ℃。胃蛋
白酶活力随温度上升变化较平缓。肠蛋白酶活力受温度影响较大，从15 ℃
到50 ℃肠蛋白酶活力上升了4-5倍，温度高于50 ℃后，酶活力又迅速下
降。胰蛋白酶活力在15 ℃~45 ℃范围内随温度升高迅速增加， 45 ℃达最
大值，其后随温度的上升酶活力又迅速下降。
胃 Stomach 5
60
50
蛋
白
酶
活
力
(
U

g
)
A
c
t
i
v
i
t
y

o
f

p
r
o
t
e
a
s
e
肠 Intestine
胰 Pancreas 10
40
30
20
10
0
1
温度 Temperature(℃)

图4-4 温度对蛋白酶活力的影响

2.3.2 温度对脂肪酶活力的影响 不同温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏脂
肪酶的活力变 化情况见图4-5。由4-5可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活力与
温度的关系曲线均呈单峰型，最适温度 均为50 ℃。胃脂肪酶活力随温度
上升变化较平缓。肠道和胰脏脂肪酶活力在15 ℃-45 ℃范围内变化不大，
45 ℃以后则迅速上升，在50 ℃达到最大值，此后在50 ℃-60 ℃范围内酶
活力又迅速下降。

2.5
2.0
1.5
1. 0
0.5
0.0
1
胃 Stomach
肠 Intestine
胰 Pancreas 10
脂
肪
酶
活
力
(
U

g
)
A
c
t
i
v
i
t
y

o
f

l
i
p
a
s
e
温度 Temperature(℃)

图4-5 温度对脂肪酶活力的影响

2.3.3 温度对淀粉酶活力的影响 不同温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏淀
粉酶的活力变 化情况见图4-6。由图4-6可知，胃、肠道和胰脏淀粉酶活力
与温度的关系曲线均呈单峰型，最适温 度均为35 ℃。胰淀粉酶活力随温
度上升变化较平缓。胃和肠道淀粉酶活力随温度上升变化较大。当温 度从
15 ℃上升到35 ℃时，胃和肠道淀粉酶活力上升了2-3倍，35 ℃时，酶活
力达到最大值。当温度继续上升时，酶活力又迅速下降。当温度达到55 ℃
时, 胃和胰脏淀粉酶活力几乎为零，当温度高于60 ℃时，肠道淀粉酶也基
本上失去了活力。

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
胃 Stomach
肠 Intestine 5
胰 Pancreas 100
淀
粉
酶
活
力
U

g
)
A< br>c
t
i
v
i
t
y

o
f

a
m
y
l
a
s
e
温度 Temperature(℃)

图4-6 温度对淀粉酶活力的影响

3 讨论
3.1 牛蛙消化酶的分布
本研究在牛蛙消化系统中检测到了蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶 活力，未
检测到明显的纤维素酶活力。蛙类通常属肉食性动物，但牛蛙消化系统中
具淀粉酶活力 ，这提示在配制牛蛙饲料时可适当添加淀粉性成分。
牛蛙消化系统中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力均 以胰脏最高，表明
胰脏是牛蛙消化酶的重要分泌器官。不同消化酶在牛蛙消化道中的活力分
布差 异较大，蛋白酶的活力以胃中最高，这与黑斑蛙
[11]
和虎纹蛙
[12]
的 相一
致。脂肪酶活力则主要分布于肠道，特别是后肠。淀粉酶活力亦主要在肠
道，以中肠较高。 牛蛙消化酶活力的分布型表明其对食物中蛋白质性成分
的消化主要在胃中进行，而对脂肪和淀粉性成分的 消化主要在肠道中进
行。根据牛蛙的这种消化特点，在配制牛蛙饲料时，不妨考虑制作复合饲
料 ，外层以蛋白质性成分为主，内层适当包裹淀粉和脂肪性成分。牛蛙吞
食饲料后，首先在胃中消化饲料外 层的蛋白质性成分，在肠道中进一步消
化饲料内层的淀粉和脂肪性成分，这样不仅可提高牛蛙的消化效率 ，而且
可提高饲料的利用率，降低养殖成本。
3.2 pH对消化酶活力的影响
酶 的活力受pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才
能表现出其活力。有关pH对蛙类 蛋白酶活力的影响有一些报道，黑斑蛙
[11]
和虎纹蛙
[12]
的胃、肠道 和胰蛋白酶的最适pH值分别为1.5、7.4和9.6，而黑
眶蟾蜍
[13]
的胃蛋 白酶最适pH值为2.2，肠蛋白酶最适pH值为9.6。牛蛙胃、
肠道和胰蛋白酶的最适pH值分别为 2.2、7.4和9.6，与这些蛙类基本一致。
有关pH对蛙类脂肪酶和淀粉酶活力影响的报道较少， 牛蛙胃、肠道和胰脂
肪酶的最适pH值分别为2.2、7.4和8.0，其胃脂肪酶的最适pH值比鱼类
[2,3]
的低，这可能与牛蛙胃内的生理pH值较鱼类低有关。肠道脂肪酶的最适pH
值与多数鱼类
[2-4]
和中华鳖
[10]
的相似。牛蛙胃、肠道和胰淀粉 酶的最适pH
值分别是7.0、8.0和9.6，在中性或碱性范围，这与多数鱼类
[5-8]
和中华鳖
[10]
淀粉酶的最适pH在碱性或中性偏酸性范围内相一致。牛蛙胃淀粉酶 活力受
pH影响曲线出现了两个峰值（pH2.2和pH7.0），这与许氏平鮋(Sebastes
schlegeli)
[5]
的胃淀粉酶相似，导致这种情况的原因尚不清楚。我们 测得牛
蛙饱食后胃和肠道内生理pH值分别为2.0-3.0和7.0~9.0，可见牛蛙饱食后消化道各部位的生理pH与不同消化酶的最适pH是相适应的。
3.3 温度对消化酶活力的影响
牛蛙属变温动物，其适宜的生存温度范围为5-35 ℃，牛蛙蛋白酶和脂
肪酶最适温度要远远 高于其栖息的环境温度，这种现象在鱼类也普遍存在
[3,8,9]
。温度对酶反应的影响很大 ，酶的蛋白质本性决定了其对温度的高度
敏感性，温度升高，一方面使酶促反应的速度加快，另一方面也 加速酶活
力的丧失，因而最适温度随反应时间延长而下降。在离体测定条件下，酶
作用时间较短 ，而在正常生活条件下，酶消化食物所用的时间相当长，这
就可以解释为什么最适温度会高于生理温度的 现象。但在离体条件下测定
的消化酶最适温度可反映消化酶的热稳定性和温度对酶活力的影响规律。牛蛙消化道蛋白酶的最适温度为45 ℃或50 ℃，脂肪酶的最适温度为50 ℃，
而淀粉酶的最适温度仅为35 ℃，表明牛蛙蛋白酶和脂肪酶的抗热性比淀粉
酶强。根据牛 蛙消化酶的这一特性，在牛蛙的人工养殖中，当环境温度升
高时，在适当增加投喂量的同时，可考虑在饲 料中适当增加蛋白质和脂肪
性成分的配比，减少淀粉性成分的配比。

参考文献
[1] 曾中平.牛蛙的养殖技术[M].北京:金盾出版社,1999.
[2] 吴仁协, 戈薇,洪万树,等.大弹涂鱼成鱼消化酶活性的研究[J].中国水产科
学,2007,14(1):9 9-105..
[3] 付新华,孙谧,孙世春,等.大菱鲆消化酶活力[J].中国水产科学,2005,12(1):26-32.
[4] 沈文燕,寿建听,祝尧荣,等.银鲫消化酶活力与pH值的关系[J].水产科学,2002，
21(6):18-22.
[5] 郑家声,冯晓燕.许氏平鮋消化道中部分消化酶的研究[J].中国水产科学, 2002,
9(4): 309-314.
[6] 陈章宝,郑曙明.淡水白鲳、团头鲂、黄颡鱼主要消 化酶活性研究[J].四川畜牧
兽医学院学报,2001,15(3):10-15.
[7] 刘金兰,严安生.乌鳢消化系统淀粉酶活力研究[J].湖北农学院学
报,1997,17(1):53 -56.
[8] 叶元土,林仕梅,罗莉,等.温度和pH对南方大口鲶和长吻鲍蛋白酶和淀粉酶活< br>力的影响[J].大连水产学院学报,1998,13(2):50-56.
[9] 李希国,李加儿,区又君.温度对黄鳍鲷主要消化酶活力的影响[J].南方水
产,2006, 2(1):43-48.
[10] 龙良启,白东清,梁拥军,等. 幼鳖胃、肠和胰脏组织中主要消化酶活力分布[J].
动物学杂志,1997, 32(6): 23-26.
[11] 张盛周,朱升学,刘明,等.黑斑蛙消化系统蛋白酶的活力[J].动物学杂志,
2004,39(1): 25-28.
[12] 张盛周,朱升学,佟嫒,等.pH值和温度对虎纹蛙消化系统蛋白酶活力的影响[J].
安徽师范大学学报, 2005, 28(2): 200-202.
[13] Teo LH, Chen TW, Tan LL et al. The Proteases of the Common Malayan Toad
Bufo melanostictus Schneider [J]. Comp Biochem Physiol, 1990, 96B(4):
715-720.
[14] 奚刚,许梓荣,钱利纯.牛蛙幼体消化酶活力及其机体主要营养 成分的研究[J].
经济动物学报,1993,3(3):50-56.