雷神3d增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明

2020年11月24日发(作者：陶春)

附件1：

增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）
保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目
1.1 动物实验
1.1.1 体重
1.1.2脏器体重比值测定：胸腺体重比值，脾脏体重比值
1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验
1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定
1.1.5单核—巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光
微球实验
1.1.6 NK细胞活性测定
2 试验原则
2.1 所列的指标均为必做项目
2.2分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两种方案, 可任选其
一进行实验.
2.3采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定
3 结果判定
3.1采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。
在细胞免疫功能、体液免疫功 能、单核－巨噬细胞功能及NK细胞活性四个
方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试 样品具有增强免疫力
作用。
其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定 细胞免疫功能
试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免
疫 功能试验结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳
性，判定单核—巨噬细胞功能 试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上
剂量结果阳性，判定NK细胞活性结果阳性。
正常动物实验需进行四个方面的测定。
3.2 采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作
用。
在免疫功能低 下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免
疫功能、单核－巨噬细胞功能及NK细胞活 性五个方面测定中，任两个方面试验
结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用 。
其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两
个剂量组结 果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目
中两个实验的结果均为阳性，或任一 个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液
免疫功能试验结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个 实验的结果均为阳
性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能试验结果
阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结
果阳性。血液白细胞 总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总
1

数结果阳性。 免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验
中，任何一项测试都不出现 加重免疫抑制剂作用的结果。

2


增强免疫力功能检验方法
Method for the Assessment of Enhancing Immune Function

1. 原理：
免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴 组织和全身各处的淋巴细
胞、抗原呈递细胞等，还包括血液中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官，主要功能
是确保T淋巴细胞的产 生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细
胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬 细胞具有清除功能，脾白髓含有
记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫 应答的
主要细胞群，按其表面标志物，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK）三大
类，T 细胞又分为CD4
+
（Th）细胞和CD8
+
T淋巴细胞。B淋巴细胞转化为 浆细胞后
能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋
白分子 都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测
上述免疫系统的各种代表性指标 的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判
定。
2. 实验动物选择
推荐用近交 系小鼠，如C57BL6J、BALBC等，6～8周龄，18～22g（BALBC
种可16-18g ），单一性别，雌雄均可，每组10～15只。
3. 剂量分组及受试样品给予时间
实验设 三个剂量组和1个阴性对照组。以人体推荐量的10倍为其中一个剂
量，另设二个剂量组。必要时设阳性 对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型
对照组。受试样品给予时间四周或30天。
4．免疫功能低下动物模型
可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。
4.1 造模原理：
3

4.1.1环磷酰胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤 淋巴细
胞，并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液
免疫有很 强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。
4.1.2氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-κB
进入细 胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化
可的松还可损伤浆细胞，抑制巨 噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以
氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、N K作用都有一定的抑制
作用。
4.2 免疫抑制剂剂量选择
环磷酰胺可选择40m g／kg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天
测定各项指标；氢化可的松可选择40mg／k g，肌内注射，隔天一次，共5次，
末次注射给药后次日测定各项指标。
各指标对两种模型敏 感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、
血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模 型比较适合迟发型变态反应、
碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根 据不
同的免疫功能指标选择合适的模型。
4.3 受试物给予
连续给予受试物4周 或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型
与预防性给药相结合的实验。
5. 实验方法
5.1血液白细胞数测定
小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法(仪器法)
全血用EDTA·K
2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对
白细胞进行分分类计数。
5.1.1仪器和材料
乙二胺四乙酸二钾（EDTA·K
2
·2H
2
O，MW404.47），离心管，全血细胞分析仪
上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷 冻离心机，全血细胞分析仪。
5.1.2实验步骤
4

5.1.2.1试剂配制
血液抗凝：EDTA·K
2
能与血液中的钙离子结 合成为螯合物，从而阻止血液凝
固，1.5～2.2mg的EDTA·K
2
可阻止1m l血液凝固。
抗凝剂配制：称量8mg EDTA·K
2
加纯净水至100ml制成 抗凝剂，50μl抗凝
剂可抗凝1ml小鼠全血。
5.1.2.2采血
以摘除小 鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或
双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂 的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，
采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动 物采集抗凝全血约
1ml。
5.1.2.3检测分析
上机前血液颠倒混匀，注 意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪
检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说 明书。
5.1.3数据分析
一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方 差齐，计算
F值，p＞0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F值≥F
0.05，P≤0.05，用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进
行统计；若变量 转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。
5.2 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
可任选下列方法之一
5.2.1 MTT法
5.2.1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞
通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其
光密度值能反映细胞的增殖情况。
5.2.1.2 仪器和材料
RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、
5

刀豆蛋 白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）
纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注
射器内芯、二氧化碳培 养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、
无菌滤器。
5.2.1.3 实验步骤
5.2.1.3.1 试剂配制
完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清， 1％谷
氨酰胺（200mmolL）， 青霉素（100UmL），链霉素（100ugL）及5×10
－5
molL
的2-巯 基乙醇，用无菌的1molL的HCl或1molL的NaOH调pH至7.0-7.2，即
完全培养液 。
ConA液 用双蒸水配制成100ugmL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）
保存。
无菌Hank's液 用前以3.5％的无菌NaHCO
3
调pH7.2-7.4。
MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1molL的HCl，临用前配制。
5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hank 's液平皿中，并在脾上面放置
一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经20 0目筛网
过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000rmin）。然后将细胞悬浮 于
2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活
细胞数（应 在95%以上），调整细胞浓度为3×10
6
个mL。
5.2.1.3.3 淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μl ConA 液（相
当于7.5μgmL），另一孔作为对照，置5％CO
2
，37℃CO
2
孵箱中培养72h。培养结
束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含 小牛血清的RPMI1640培
养液，同时加入MTT（5mgmL）50μl 孔，继续培养4h。培 养结束后，每孔加入
1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然< br>后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以
570nm波长测 定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上
6

在波长570nm测定OD值。
5.2.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据 进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正 态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度 值代表淋巴细胞的增殖能
力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结
果阳性。
5.2.1.5 注意事项
ConA的浓度很重要，浓度过低不能刺激足 够的细胞增殖，浓度过高会抑制
细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳浓度。
5.2.2 XTT法
5.2.2.1原理
由于MTT经还原所产生的甲臜产物不 溶于水，且溶解甲臜的有机溶剂有毒
性，可选择XTT法替代MTT法。其原理是：XTT是二甲氧唑黄 ，在电子耦合
试剂存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的
橘 黄色的甲臜，生成的甲臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶
联免疫检测仪检测定吸光值 。
5.2.2.2实验步骤
脾细胞悬液制备同MTT法；
淋巴细胞增殖反应：调 整细胞浓度为5×10
7
，取细胞悬液100μl分别加入
96孔培养板中，一孔加5 ～10μl ConA 液，另一孔作为对照，设2个平行孔，置
37℃5％CO
2
饱 和湿度孵箱中培养72h。培养结束前4h，向各孔中加入20～50μl
的XTT工作液（按试剂盒说 明现用现配），孵育4小时。用酶标仪在450nm波
长处检测每孔的光密度。
5.2.2.3 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
7

计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0.05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正 态或方差不齐
的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统 计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
用加ConA孔的光密度值 减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能
力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光 密度差值，可判定该项实验结
果阳性。
5.2.2.4 注意事项
细胞浓度及培养时间在实验前要预试，以找到最佳效果。
5.2.3 溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法(BrdU-ELISA法)
5.2.3.1 原理
T淋巴细胞在有丝分裂原ConA等的刺激下产生增殖反应，BrdU可竞争掺入
到增 殖细胞中新合成的DNA链内，将BrdU标记的细胞作为抗原结合到固相载体
表面，加入酶连接的抗- BrdU抗体，使BrdU抗原与酶标抗体充分结合，抗原抗
体复合物与底物作用后产生有色物质，其光 密度可反映细胞增殖的程度。
5.2.3.2 仪器和材料
低温离心机，全自动酶标仪、超 净工作台、二氧化碳培养箱、96孔培养板
（平底）、倒置显微镜、移液器、手术器械、200目筛网、 细胞活性分析仪；RPMI1640
细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA ）、Hank's液、PBS
缓冲液（pH7.2-7.4）、BrdU细胞增殖检测试剂盒（ELIS A）、纯净水、终止液。
5.2.3.3 实验步骤
5.2.3.3.1 试剂配制
完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨
酰胺（ 200mmolL），青霉素（100UmL），链霉素（100μgL）及5×10
－5
mo lL的
2-巯基乙醇，用无菌的1molL的HCl或1molL的NaOH调pH至7.0-7.2， 即完
全培养液。
ConA液 用双蒸水配制成100ugmL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）
保存。
无菌Hank's液 用前以3.5％的无菌NaHCO
3
调pH7.2-7.4。
8

BrdU标记液 将标记剂（试剂盒No.1）按1：100的比例加到培养液中混匀，
现配现用。
抗体贮存液（母液） 在Anti-BrdU- POD（试剂盒No.3）中加1.1ml双蒸水
充分混合，存于-20℃备用。
抗体工作液 每100μl抗体母液加10ml抗体稀释液（试剂盒No.4），现配现
用。
洗液 每10ml清洗缓冲液（试剂盒No.5）加100ml双蒸水。
5.2.3.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布 ，
用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用
Hank's 液洗2次，每次离心10min（1000rmin）。然后将细胞悬浮于2mL的完全
培养液中，用全 自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应
在95%以上），调整细胞浓度为2×1 0
7
个mL。
5.2.3.3.3 淋巴细胞培养
将细胞加入96孔培养 板中，10μl孔，每份细胞加2孔，第1孔再加入90μl1640
培养液，第2孔加入85μl16 40培养液和5.3μl ConA，同时设3个空白孔，每孔
仅加100μl 1640培养液，置5%CO
2
、37℃培养箱孵育72h，培养结束前4 h加入
BrdU标记液，10μl 孔，培养结束后离心（1000rmin,10min）,弃上清，吹干细
胞，放4℃冰箱保存待测。
5.2.3.3.4 酶联免疫吸附测定
每孔加200μl固定液，常温放置30min后,吸弃固定液。加入100μl BrdU抗
体工作液，37℃孵育60min；吸弃未结合的抗体，加250μl洗液洗3次，轻拍移
去洗液。加底 物溶液（含TMB）100μl 孔，常温孵育15min。用酶标仪测量吸光
值，不加终止液时，测定 发射波长为370nm（记为A
370
），参考波长492nm（记为
A
49 2
）；加终止液时，测定发射波长为450nm（记为A
450
），参考波长690n m（记为
A
690
）。
5.2.3.4 数据处理及结果判定
计算每孔标记指数（LI），LI= （A
370
- A
空白370
）- （A
492
- A
空白492
）或LI= （A
450
-
A
空白450
）- （A
690
- A
空白690
）。用加ConA孔的LI值减去不加 ConA孔的LI值所得
9

的差值代表淋巴细胞的增殖程度。
采用方差分析对标记指数差值进行统计学分析， 按方差分析的程序先进行方
差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F
0.05
，则 各组均数间差异无显著性；F
值≥F
0.05
,P≤0.05,用多个实验组和一个对 照组间均数的两两比较方法进行统计；
对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方 差齐要求后，
用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩
和 检验进行统计。
受试样品组的LI值差值显著高于对照组的LI值差值，可判定该项实验结果
阳性。
5.2.3.5 注意事项
选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会 产生抑制作用，
不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。
5.3 迟发型变态反应（DTH）
迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法，当致敏T细胞再次与抗原接触，
引起T细胞活化，释放出多种细胞因子，致局部组织发生以单核细胞为主的炎症
反应，一般在2 4～48h达高峰。可任选下列方法之一试验。
5.3.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）
5.3.1.1 原理
二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T
淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7d 后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局
部肿胀，一 般在抗原攻击后24～48h达高峰，其肿胀程度可以反映迟发型变态反
应程度。
5.3.1.2 材料
DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
5.3.1.3 实验步骤
5.3.1.3.1 试剂配制
DNFB溶液 DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将
预先配好的5mL丙酮麻油溶 液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶
布密封。混匀后，用250μl注射器通过瓶盖 取用。
10

5.3.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm×3cm、用 DNFB 溶
液50μl均匀涂抹致敏。
5.3.1.3.3 DTH的产生与测定 5天后，用 DNFB 溶液 10μl均匀涂抹于小鼠右耳
（两面）进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器
取下直径8mm的耳片，称重。
5.3.1.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据 进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正 态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量 差值显著高于与对照
组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。
5.3.1.5 注意事项：
操作时应避免DNFB与皮肤接触。
5.3.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）
5.3.2.1 原理
S RBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，
攻击部位出现肿胀，其 肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。
5.3.2.2 仪器与材料
游标卡尺（精密度0.02mm）、SRBC、微量注射器（50μl）、足趾容积测量仪。
5.3.2.3 实验步骤
5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2％(vv)SRBC腹 腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL（约
1×10
8
个SRBC）。
5.3.2.3.2 DTH的产生与测定 免疫后4天，测量左后足跖部厚度或肿胀度，
然后在测量部位皮下注射20％(vv)SRBC，每只鼠20μl （约1×10
8
个SRB C），
注射后于24h测量左后足跖部厚度或肿胀度，同一部位测量三次，取平均值。
测量方 法：用游标卡尺测量肉眼读数。或用足趾容积测量仪进行测量足跖部
肿胀度，操作方法按仪器操作指引进 行。
11

5.3.2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据 进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正 态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值来表示DTH 的程度。受试样品组的差
值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
5.3.2.5 注意事项
前后两次测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加
压，否则会影响测量结果。
攻击时所用的SRBC要新鲜（保存期不超过1周）。
5.4 抗体生成细胞检测（改良法）
5.4.1 原理
溶血空斑试验是检测产生IgM、 IgG等抗体分泌细胞数体外试验法。用绵羊
红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SR BC混合，在补体参与下，
使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。
5.4.2 仪器和材料
溶血空斑自动图象分析仪、二氧化碳培养箱、恒温水 浴、离心机、手术器械、、
200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1 640培养液、SA缓冲液
（C
4
H
4
N
2
O3
0.46g, MgCl
2
0.1g, CaCl
2
.2H
2
O 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO
3
0.252g and
C
8
H
11
N
2
NaO
3
0.3g, 加蒸馏水至1000mL）、灭菌生理盐水、琼脂糖。
5.4.3 实验步骤：
5.4.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一
个方向摇动，以脱纤维，生理盐水2500rpmmin，15min，洗涤3次，制备压积
SRBC ，放入4℃冰箱保存备用。
5.4.3.2 完全培养基的制备：新生小牛血清经绵羊红细胞（vv ，5：1）吸收，
4℃，30-60min后，加入不完全培养基RPMI 1640中，制备成含20%小牛血清的
完全培养基。
12

5.4.3.3 补体制备 股动脉取血，静置30-60min，2500rpmmin，15 min分离
血清，将5-10只豚鼠血清混合后，与压积SRBC以5：1（vv）比例混合，4℃冰箱放置30-60min，间或震荡，2500rpmmin，15min分离血清，分装，-80℃冰< br>箱保存。用时以完全培养基1：10（vv）比例稀释。
5.4.3.4 免疫动物 压 积SRBC以生理盐水制成2%（vv）的细胞悬液（约1
×10
8
个SRBC），每 只鼠腹腔注射0.2mL。
5.4.3.5 脾细胞悬液制备 将SRBC免疫4-5天后的小 鼠颈椎脱臼处死，无菌
取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个< br>细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpmmin，10min，去上清，Hank’液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成5×10～1×10个细胞mL的脾细胞悬液。
5.4.3.6 空斑的测定
5.4.3.6.1 底层培养基制备 0.5g琼脂糖加 入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，
待温度于50℃左右时，以1mL孔的量加至六孔培养板中， 琼脂凝固后备用。
5.4.3.6.2 顶层培养基制备 0.5g琼脂糖加入100mL Han k’s液中（PH7.2-7.4）,
加热溶解，以0.5mL试管的量加至46-50℃恒温的试管中 。
5.4.3.6.3 铺板： 50μl 20%SRBC（生理盐水配制，vv）、200μl 脾细胞悬液先
后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，
每个样本做两个平行孔。
5.4.3.6.4 空斑测定：已制备好培养板放入37℃、5% CO 2培养箱中孵育1h，然
后每孔加入500μl以完全培养基稀释的补体（vv，1：10），继续孵育 2h，自动
图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均
值为 样本的溶血空斑数值，以空斑数10脾细胞表示。
5.4.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,
用多个实验组和一个 对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不
齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或 方差齐要求后，用转换后的数据进
行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进 行统计。
用空斑数10脾细胞或空斑数全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著
6
6
67
13

高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
5.5 血清溶血素的测定
可任选下列方法之一。
5.5.1 血凝法
5.5.1.1 原理
用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利 用其凝集SRBC的程度
来检测溶血素的水平。
5.5.1.2 仪器和材料
SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机
5.5.1.3 实验步骤
5.5.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝
一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
5.5.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心
(2000rmin)10min。将 压积SRBC用生理盐水配成2％（vv）的细胞悬液，每只
鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4～5d 后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，
将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rmin 离心10min，收集血清。
5.5.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同 稀释度的血清分别置
于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(vv)的 SRBC悬液，混
匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
5.5.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据 进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正 态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
血清凝集程度一般分为5级（0－Ⅳ）记录，按下式计算 抗体积数，受试样
品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。
抗 体水平＝（S
1
+2S
2
+3S
3
??nS
n）
式中1、2、3??n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数
14

越大，表示血清抗体越高。
0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。
Ⅰ级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
5.5.1.5 注意事项
血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。
5.5.2 半数溶血值（HC
50
）的测定
5.5.2.1 原理
用SRB C免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），在补体参与下，与SRBC
一起孵育，可发生溶血反应 ，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血
清中溶血素的含量。
5.5.2.2 仪器和材料
分光光度计、全自动酶标仪、恒温培养箱、96孔培养板、离心机、恒温水
浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液（C
4
H
4
N
2< br>O
3
0.46g, MgCl
2
0.1g, CaCl
2
.2H
2
O
0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO
3
0.252g and C
8
H
11
N
2
NaO
3
0.3g, 加蒸馏水至1000mL）、
都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g， 加蒸馏水至1000mL）
5.5.2.3 实验步骤
5.5.2.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一
个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备 用，可保存2周。
5.5.2.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合 血清），
将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取< br>上清，分装，－70℃保存。用时以SA缓冲液按1∶8稀释。
5.5.2.3.3 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心
(2000rmin)10min。将 压积SRBC用生理盐水配成2％（vv）的细胞悬液，每只
鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5d 后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，
使血清充分析出，2000rmin离心10min，或6 000rmin,4min,收集血清。
5.5.2.3.4 溶血反应测定
15

5.5.2.3.4.1检测方法1（分光光度计测定）：
取血清用SA缓冲液稀 释（一般为200～500倍）。将稀释后的血清1mL置试
管内，依次加入10％(vv)SRBC 0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设
不加血清的对照管（以SA液代替）。置37 ℃恒温水浴中保温15～30min后，冰
浴终止反应。2000rmin离心10min。取上清液1 mL，加都氏试剂3mL，同时取
10％(vv)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混 匀，放置10min后，于540nm
处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
5.5.2.3.4.2检测方法2(全自动酶标仪测定)：
设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清10μl,用1mL 1:5稀释的SA缓冲液
稀释；每孔加入稀释后的血清100μl；空白对照孔：每孔加入100μl 1:5稀释的
SA缓冲液，再依次加入10％(vv)SRBC 50μl，补体100μl（用SA溶 液或PBS溶
液按1:8稀释），置37℃恒温水浴中保温30min，1500rmin离心10mi n。然后样
品孔和空白对照孔各取上清液50μl加入另一个96孔培养板内, 加都氏试剂
150μl。 同时设半数溶血孔, 加入10％(vv)SRBC 12.5μl,再加都 氏试剂至200μl。
用震荡器充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔 光密度
值。
5.5.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据 进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正 态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
溶血素的量以半数溶血值（HC
50
）表示，按下列公式计算：

样品光密度值
样品HC
50
＝─────────────────×稀释倍数
SRBC半数溶血时的光密度值
样品光密度值- 空白光密度值
或样品HC
50
＝─────────────────────×稀释倍数
SRBC半数溶血时的光密度值-空白光密度值
16

受试样品组的HC
50
显著高于对照组的HC
50
，可判定该项实验 结果阳性。
5.6 小鼠碳廓清实验
5.6.1 原理
在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。
以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标 ，两者呈直线关系。此直线斜率(K)
可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬 指数a表示。
5.6.2 仪器和试剂
分光光度计、全自动酶标仪、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na
2
CO
3

5.6.3 实验步骤
5.6.3.1 溶液配制
注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。
Na
2
CO
3
溶液 取0.1gNa
2
CO
3
，加蒸馏水至100mL。
5.6.3.2 注射墨汁 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重
0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。
5.6.3.3 测定
注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl ，并立即将其加到 2mL
0.1%Na
2
CO
3
溶液中。用分光 光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值
（OD），以Na
2
CO
3
溶液作空白对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a：

lgOD
1
-lgOD
2

K＝───────
t
2
－t
1


体重
3

吞噬指数a＝ ─────── ×
肝重＋脾重

K
5.6.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0. 05,用
17

多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态 或方差不齐
的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计 ；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳
性。
5.6.5 注意事项
静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。
墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。
使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20～
30min内不易廓清。
5.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验方法
5.7.1原理：激活的巨噬细胞具有吞噬 表面带有阳性可调理基团的荧光微球，将
含有巨噬细胞的腹腔液与调理过的荧光微球孵育一定时间后，去 除多余未被吞噬
的微球，收集以巨噬细胞为主的标本，用流式细胞仪检测巨噬细胞，计数吞噬荧
光微球的巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。
5.7.2仪器和材料
Hank's液，小牛血清，PBS缓冲液，生理盐水，荧光微球(?2?m)， 1％小
牛血清白蛋白（BSA）。
流式细胞仪，超声清洗仪，二氧化碳细胞培养箱，离心机， 6孔培养板，细
胞刮，过滤器（75?m）,流式上样管，流式细胞仪专用鞘液，移液枪及吸头，白细胞计数板，手术器械一套，注射器，滴管，胶头吸管。
5.7.3 实验步骤
5.7.3.1试剂配制
5.7.3.1.1 含5％小牛血清的Hank's液：取10ml小牛血清加入200ml Hank's
液中，混匀，临用前配。
5.7.3.1.2 PBS缓冲液的配制方法：KH
2
PO
4
6.66g，Na
2
HPO
4
·12H
2
O 6.38g，将
上述试剂溶于1000ml蒸馏水中调PH值至7.2即成。
5.7.3.1.3 2％绵羊红细胞悬液的配制方法：实验前取绵羊颈静脉血，置于盛
有 玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5～10分钟，除
18

去纤维蛋白，用生理盐水洗涤3次，每次1500rPm，离心10分钟，4℃冰箱保存。
实验前弃去 上清，按血球压积用生理盐水配制成2％的红细胞悬液。
5.7.3.1.4 1％BSA的配制：0.5gBSA溶于50mlPBS缓冲液中，临用前配较好。
5.7.3.1.5 荧光微球预调理：100μl荧光微球与10ml 1％BSA 37℃避光孵育
30min, 超声处理5min，临用前配。
5.7.3.2 腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球过程
实验前4天给每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%绵羊血红细胞激活小 鼠巨噬细胞，
实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，吸取
腹腔洗液2ml用7 5?m过滤器过滤至试管内，调整巨噬细胞数为4～6×10ml。
用移液枪吸取1ml腹腔洗液于6孔 培养板中，加入已经预调理过的荧光微球（1
×10
7
板），37℃二氧化碳细胞培养 箱（或室温）避光孵育90～120分钟，孵育
结束后弃上清（含未贴壁细胞和多余荧光微球），每次使 用1.0mlPBS缓冲液轻轻
洗涤2次，去上清后再加入4℃PBS缓冲液0.3ml，用细胞刮刮下 贴壁细胞，轻
轻吹打均匀后经75?m过滤器过滤后上机分析。
5.7.3.3 流式细胞仪检测分析
5.7.3.3.1 设门：首先设立FSC-SSC二维散点图，通过调节F SC和SSC电压值，
以巨噬细胞设门界定分析的巨噬细胞群，最大限度地排除其它有核细胞、细胞碎< br>片等的干扰；
5.7.3.3.2 获取：在荧光微球发射光的荧光通路检测巨噬细胞的荧 光强度，每
份样本获取5000个巨噬细胞，数据可显示于二维散点图和直方图中。在二维散
点 图中可通过设门圈定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细
胞群；在直方图中可通过标尺 标定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球
的巨噬细胞群，全部数据经相关软件分析未吞噬荧光微 球的巨噬细胞和吞噬不同
数量荧光微球的巨噬细胞的比例。






19
5




吞噬一个荧光微球 吞噬二个荧光微球
图 1 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞图(荧光显示400?)
R2
R3R4R5R6
R1

图2 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FSC-SSC和FL2-SSC二维散点图

R1:
总巨噬细胞群

R2:
未吞噬荧光微球的巨噬细胞群
R3:
吞噬一个荧光微球的巨噬细胞群

R4:
吞噬两个光微球的巨噬细胞群
R5:
吞噬三个荧光微球的巨噬细胞群

R6:
吞噬四个或四个以上荧光微球的巨噬细胞群



RegionR1
R2
R3
R4
R5
R6
% Gated
1 00.00
65.70
19.39
8.84
4.10
1.12
Y Mean
289.75
261.77
319.14
363.63
410.94
441.94
Marker
M1
M2M3M4M5
% Gated
100.00
65.65
19.56
8.91
4.05< br>1.05
Median
2.33
1.70
691.58
124 0.94
1700.08
2287.57
All
M1
M2
M 3
M4
M5


20



图 3 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FL2直方图
5.7.4 数据处理及结果判定
吞噬荧光微球的巨噬细胞数
吞噬百分率（%） = ─────────────── ×100
计数的巨噬细胞数
被吞噬的荧光微球总数
吞噬指数= ─────────────
计数的巨噬细胞数
以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行
数据转换，X＝Sin
-1
p
，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差
分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值 < F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,p≤ 0.05,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的 数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达 到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百 分率、吞噬指数比较，
差异均有显著性，可判定该项实验结果阳性。
5.7.5 注意事项
5.7.5.1 颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管破裂出血，导致腹腔洗液中混杂大量红细胞，影响流式细胞仪的结果分析。
5.7.5.2 孵育、细胞洗涤和上机全程注意避光，以保持微球荧光稳定性。
5.7.5.3 巨噬细胞、荧光微球浓度要根据试剂说明书调整合适，否则影响结果
准确性。
5.7.5.4 细胞处理过程要轻柔，尽量减少碎片和杂质对结果分析的影响。
5.7.5.5 腹水细胞上机前一 定要用足够标准的滤器过滤，调理后多余的荧光微
球要尽量去除，以防止流式细胞仪堵塞。
5.8 NK细胞活性测定
21

NK细胞是没有T和B细胞表面标志 的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用。
可任选下列方法之一测定。
5.8.1 乳酸脱氢酶（LDH）测定法
5.8.1.1 原理
正常情况下，活细胞的胞浆内 含有的LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK
细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸 锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，
后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四 氮唑（INT），INT 接
受H
＋
被还原成紫红色甲月赞 类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。
5.8.1.2 仪器和材料
酶标 仪、全自动细胞计数仪、YAC-1细胞、Hank's液（pH7.2～7.4）、RPMI1640
完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、
NAD、0 .2molL的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）、1％NP40或2.5%Triton
5.8.1.3 实验步骤
5.8.1.3.1 LDH基质液的配制
乳酸锂 5×10
-2
molL
硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10molL
吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10
-4
molL
氧化型辅酶Ⅰ（NAD） 1.3×10
-3
molL
将上述试剂溶于0.2molL的Tris- HCl缓冲液中（pH8.2）
5.8.1.3.2 靶细胞的传代（YAC-1细胞）
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640
完全培养液 调整细胞浓度为4×10个mL。
5.8.1.3.3 脾细胞悬液的制备（效应细胞）
无 菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一块
纱布，用大号注射器内芯轻 轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，
用Hank's液洗2次，每次离心10min （1000rmin）。弃上清将细胞浆弹起，加
入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0. 5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s
液，1000rpm，10min离心，然后将细胞悬 浮于2mL的完全培养液中，用全自动
细胞计数仪计数脾细胞；或用1mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液重悬，
5
-4
22

用1%冰醋酸稀释后计数 (活细胞数应在95%以上)，用台酚兰染色计数活细胞数
（应在95%以上），最后用RPMI164 0完全培养液调整细胞浓度为2×10
7
个mL。
5.8.1.3.4 NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100μl（效靶比50:1），加入U型96孔培养板中； 靶
细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％
NP40 或2.5%Triton各100μl ；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO
2
培养 箱
中培养4h，然后将96孔培养板以1500rmin离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1molL
的H Cl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。
按下式计算NK细胞活性：

反应孔OD－自然释放孔OD
NK细胞活性％＝ ────────────────── × 100%
最大释放孔OD－自然释放孔OD
5.8.1.4 数据处理及结果判定
NK细胞活性需进 行数据转换，X＝Sin
-1
p
，式中P为NK细胞活性，用小数
表示，然后 再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方
差齐性检验，方差齐，计算F值，F 值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；
F值≥F
0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统
计；对非正态或方差不齐 的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求
后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未 达到正态或方差齐的目的，改
用秩和检验进行统计。
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实
验结果阳性。
5.8.1.5 注意事项
靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95％
比色时环境温度应保持恒定
LDH基质液应临用前配制
在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。
5.8.2 同位素
3
H-TdR测定法
23

5.8.2.1 原理
将用同位素
3
H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被N K细
胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成
正比。通过 测定靶细胞H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。
5.8.2.2 仪器和材料
液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、
3
H-TdR、RPMI1640 完全
培养液、Hank's液(pH7.2～7.4)、YAC-1细胞、Triton X-100
5.8.2.3. 实验步骤
5.8.2.3.1 靶细胞的标记
取传代后24h生长良好的YAC-1细胞（存活率>95％）按1×10mL YAC-1
细胞悬液加
3
H-TdR 10uCi进行标记，于37℃、5％CO2
培养箱中培养2h，每30min
振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培 养液中，使细胞浓度为1
×10
5
个mL。
5.8.2.3.2 脾细胞悬液的制备（效应细胞）
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用 镊子轻轻将脾撕碎，
制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心
10min(1000rmin)。然后将细胞悬浮于2ml 的完全培养液中，用台酚兰染色计数
活 细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10
7
个 mL。
5.8.2.3.3 NK细胞活性测定
在96孔培养板中每孔加100 μl标记的靶细胞，实验孔加100μl效应细胞，
空白对照孔加100μl培养液，最大释放孔加10 0μl 2.5% Triton X-100。每个样
品设3个复孔，置5%CO
2
、37℃培养箱内温育4h，用多头细胞收集器将细胞收集
在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。
按下式计算NK细胞活性：

实验孔cpm
NK细胞活性%=(1－ ──────────────────) ×100%
空白对照孔cpm － 最大释放孔cpm
6
3
5.8.2.4 数据处理及结果判定
24

NK 细胞活性需进行数据转换，X＝Sin
-1
p
，式中P为NK细胞活性，用小
数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，
计算F值，F值< F
0.05
,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F
0.05
,P≤0.0 5,用
多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐
的数据进 行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行
统计；若变量转换后仍未达到正态 或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验
结果阳性。
5.9 增强免疫力功能结果判定：
5.9.1 经正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。
在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细 胞功能及NK细胞活性四个
方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫 力
作用。
其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免
疫功能试验结果阳性 。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳
性，判定单核—巨噬细胞功能试验结果阳性。N K细胞活性测定实验的一个以上
剂量结果阳性，判定NK细胞活性结果阳性。
正常动物实验需进行四个方面的测定。
5.9.2 经免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作
用。
在免疫功能低下 模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免
疫功能、单核－巨噬细胞功能及NK细胞活性 五个方面测定中，任两个方面试验
结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。
其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两
个剂量组结果阳 性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目
中两个实验的结果均为阳性，或任一个实 验的两个剂量组结果阳性，可判定体液
免疫功能试验结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验 的结果均为阳
性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能试验结果
2 5

阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结
果阳性。血液白细胞总数测定的二个剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结
果阳性。
免 疫功能低下模型动物实验需进行任三个方面项目的测定。同时在各项实验
中，所测项目都不出现加重免疫 抑制剂作用的结果（表现为一个以上剂量组低于
模型对照组，P≤0.05）。
26


增强免疫力功能评价方法修订说明

一、承担单位
广东省疾病 预防控制中心为主要承担单位，本次任务来源于国家食品药品监
督管理局保健食品化妆品监管司的委托， 对《保健食品检验与评价技术规范（2003
年版）》中“增强免疫力功能评价程序和检验方法”进行修 订。

二、主要工作过程
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于200 9年4月召开了“保
健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控
制中心、北京市疾病 预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究
院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健 食品审评中心的专家近15人，会
上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了 充分的讨
论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。为了做好本次检验方法的修订工
作，广 东省疾病预防控制中心成立了“增强免疫力功能评价程序和检验方法”修
订的起草工作小组，经查阅国内 外相关资料，参考国家食品药品监督管理局保健
食品化妆品监管司召开的工作会议的精神，咨询有关专家 和实验室同行的意见和
建议，形成了本次任务的工作方案，总体上要提高检验方法的科学性、准确性和< br>客观性，提高保健食品功能的技术标准。本次修订主要工作：建立和完善免疫低
下模型方法，增加 总体免疫功能评价方法指标，增加应用Brdu掺入标记法检测
LPS和ConA诱导的小鼠淋巴细胞转 化功能方法，增加单核-巨噬细胞吞噬荧光微
球试验方法，改良发型变态反应（DTH）测量方法，形成 “增强免疫力功能”评
价检验方法修改，在此基础上提出相应的判定标准。经过起草工作小组开展的大< br>量条件探索和实验方法研究，对各种实验结果进行了比较和取舍，形成了修订初
稿后，起草工作小 组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复
修改，形成征求意见稿。方法验证工作由广 东省疾病预防控制中心、湖南省疾病
预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心 分别进行验
27

证试验。在此基础上，征集、整理和归纳了相关意见和建议。 < br>国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2010年8月再次召开了
“保健食品功能评价 方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国
疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省 疾病预防控制中心、上海市疾病预
防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院 、中国中
医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操
作性作 了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了
进一步完善，并邀请北京市疾病 预防控制中心进行部分项目的验证，综合了方法
验证单位的意见后形成了征求意见稿。
201 1年7月22日国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司在北京宣
武门商务酒店召开了“保健食品 功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，
参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北 京大学、广东省疾病预防
控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究
院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审
评中心的专家1 4人，会上对修订后的“增强免疫力功能评价程序和检验方法”
的科学性、客观性和可操作性给予肯定， 并提出修改意见，对征求意见稿做了进
一步完善。

三、编制原则
1、总 原则，提高保健食品“增强免疫力功能评价程序和检验方法”的科学
性、准确性和规范性，适应当前法规 对加强保健食品监管的要求。
2、修订内容要符合当前增强免疫力功能评价的基础理论，既考虑原规范 合
理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的
指标要在国内 外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品增强免疫力
的功能作用。
3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。

四、确定相关技术内容及新旧方法的对比


28

编
号
1
原方法
序号

内容

现方法
序号
1
内容
原理
修订理由
增加“原理”条款，概括了
实验原理
2 1 实验动物 2 实验动物选择 更改标题及序号，详细描述
原方法内容
3 2 剂量分组及
受试样品给
予时间
3 剂量分组及受试样品
给予时间
更改标题序号，增加免疫低
下模型法分组内容
4 4 免疫功能低下动物模
型
增加建立免疫功能低下动物
模型的详细方法
增加“外周血白细胞测定”
内容
5 5.1 外周血白细胞测定
6 3.1.1.3.2 脾细胞悬液
制备

5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备

更改标题序号，对原方法内
容进行了简化
7
8




5.2.2
5.2.3
XTT法
溴脱氧尿嘧啶核苷标
记酶联免疫吸附测定
法(BrdU-ELISA法)
增加XTT法内容
增加“溴脱氧尿嘧啶核苷标
记酶联免疫吸附测定法
(BrdU-ELISA法)”内容
取消方法 9 3.1.1.4 同位素渗入
法

10 3.2.2.2 材料 5.3.2.2 材料 更改标题序号，增加足趾容
积测量仪为测量仪器
11 3.2.2.3.2 DTH的产生与
测定
5.3.2.3.2 DTH的产生与测定 更改标题序号，引入肿胀度
作为仪器测量的指标
12 3.2.2.4 数据处理和
结果判定
5.3.2.4 数据处理和结果判定 更改标题序号，引入肿胀度
指标
13 3.3 抗体生成细
胞检测
5.4 抗体生成细胞检测（改
良法）

更改标题及序号，对原方法
进行改良
（Jerne改良
玻片法）
14 3.3.2 仪器和材料 5.4.2 仪器和材料 更改标题序号，增加溶血空
斑自动图象分析仪及SA缓
冲液具体配方
15
16
3.3.3.1

SRBC

5.4.3.1
5.4.3.2
SRBC
完全培养基的制备
增加了羊血洗涤的操作方法
增加了完全培养基的制备方
法
17 5.4.3.3 补体制备 增加了补体制备具体操作方
法
18
19
3.3.3.3
3.3.3.4
玻片涂膜
免疫动物

5.4.3.4

免疫动物
取消
将羊血洗涤步骤调入到
29

“5.4.3.1 SRBC”中
20 3.3.3.5 脾细胞悬液
制备
21 5.4.3.6.1


22
23




5.4.3.6.2
5.4.3.6.3

顶层培养基制备
铺板
增加了顶层培养基制备方法
用六孔板代替玻片作为载
体，增加了铺板的具体操作
方法
24 5.4.3.6.4

25 3.4.2.2 仪器和材料 5.5.2.2

26 3.4.2.3.4 溶血反应 5.5.2.3.4 溶血反应测定
仪器和材料
空斑测定 改用溶血空斑自动图象分析
仪计数空斑
增加分光光度计、全自动酶
标仪等仪器和材料
更改标题及序号，将原方法
细分为分光光度计及全自动
酶标仪测定两种方法

27 5.5.2.3.4.1 检测方法1（分光光度

28
计测定）
增加全自动酶标仪测定的具
体操作方法
增加全自动酶标仪测定结果
的半数溶血值计算公式
仪器和试剂 增加全自动酶标仪
增加标题
底层培养基制备
5.4.3.5 脾细胞悬液制备 更改标题序号，对原方法内
容进行了简化
增加了底层培养基制备方法
5.5.2.3.4.2 检测方法2(全自动酶
标仪测定)
数据处理及结果判定 29 5.5.2.4

30 3.5.2 仪器和试剂 5.6.2

31 3.5.3.3 测定 5.6.3.3 测定 增加全自动酶标仪作为测定
仪器
32 3.6 小鼠腹腔巨
噬细胞吞噬
鸡红细胞试
验
取消
33
5.7

小鼠腹腔巨噬细胞吞
噬荧光微球试验方法
取消“小鼠腹腔巨噬细胞吞
噬鸡红细胞试验”，增加“小
鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微< br>球试验方法”作为替代，
34 3.7.1.2 仪器和材料 5.8.1.2

仪器和材料 增加全自动细胞计数仪
35 3.7.1.3.3 脾细胞悬液
的制备（效应
细胞）
5.8.1.3.3

脾细胞悬液的制备（效
应细胞）
更改标题序号，对原方法内
容进行了简化， 引入全自动
细胞计数仪作为细胞计数方
法之一
36 4 增强免疫力5.9 增强免疫功能结果判修改标题序号
30

功能的结果
判定
37
定
5.9.1

经正常动物实验，受试
样品具有增强免疫力
作用
修改“试验结果阳性”的判
定内容
38 5.9.2

经免疫功能低下动物
实验，受试样品对免疫
功能低下者具有增强
免疫力作用
1、增加“免疫功能低下动物
实验的结果判定”内容，
2、规定项目测定的要求。



31