胆囊炎吃什么好胃癌细胞表面-唾液酸糖链的表达与其侵袭、

2020年11月20日发(作者：倪光炯)



胃癌细胞表面,唾液酸糖链的表达与其与侵染、转移相关
性的研究







1 20


摘 要

本设计为了研究唾液酸在胃癌发病过程中的相关作用，探讨,唾 液酸糖链
结构在胃癌发生中所造成的影响。设计内容主要分为两部分：,唾液酸糖链结
构在不同 分化程度的胃癌细胞表面的表达对胃癌细胞侵染能力相关性的研究；,
唾液酸糖链结构对胃癌细胞的转移 能力相关性的研究；第一部分分为两个实验
设计用MAL细胞化学染色法选出阳性细胞计算出MAL胃癌 细胞的阳性率和
体外细胞粘附试验测得吸光度测试唾液酸跟细胞粘度的关系；第二部分通过重
组 基底膜实验来计数胃癌细胞的穿膜细胞数，确定,唾液酸对胃癌细胞的侵染、
转移的影响。为胃癌疾病的 研究和治疗提供一定的理论及实验基础。

关键词：,唾液酸；表达；胃癌细胞；侵染；转移

















目 录

第一部分： 文献综述
1 唾液酸 ......................... ................................ 0
1.1简介 ..... ................................................. 0
1.2唾液酸的生物学功能 ........................................ 0
2 胃癌 ............................................... ............ 1
2.1胃癌发生的过程 ............................................ 1
2.2胃癌的侵染、转移 .......................................... 1
3 唾液酸与肿瘤作用 ............................................... 2
3.1唾液酸与恶性肿瘤 .......................................... 2
3.2唾液酸与胃癌 .............................................. 3
4凝集素 ......................................... ................. 4
4.1简介 .................... .................................. 4
4.2 MAL简介 .................................................. 4
4.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记 .............................. 5
第二部分 课程设计部分
1材料 .......................................... .................. 7
1.1细胞株及细胞培养 .......................................... 7
1.2试剂 ........................................ .............. 7
1.3试剂配制 .................................................. 7
1.4仪器设备 .................................................. 8
2方法 ........................................ .................... 9
2.1 MAL细胞化学染色 .......................................... 9
2.2 体外细胞粘附试验 ......................................... 10
2.3 重组基底膜侵袭实验 ....................................... 10
3 设计 ............................................... ........... 11
3.1 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其转移能力的相关性 .......... 11
3.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性 .......... 11
1 20
4 总结 ................. ......................................... 12
5 设计体会 ............................................. ......... 12
参考文献 ............................ ............................ 13
















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第一部分 文献综述
1 唾液酸
1.1简介

唾液酸是一种神经氨酸乙酰衍生物，广泛分布于体内各组织中， 被认为是重要
的肿瘤标志物，并在检测疗效、复发和预后判断等方面都有一定的价值。唾液酸是
一类含个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称，在人体的唾液酸主要为N-乙酰神
经氨酸和N-羟乙酰 神经氨酸两种，大多由葡萄糖代谢生成。唾液酸广泛分布于真核
细胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖链的最末端 ，是细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要成分
[1]
。
体内大多是葡萄糖代谢生成，在血清中 以糖结合和脂结合两种形式存在。根据唾液
酸与糖残基的连接方式可将其分为,α 2,3-、α 2,6-或α 2,8-三大类。
1.2唾液酸的生物学功能

唾液酸具有的末端定 位性及带负电荷两大特性，使他们对调节细胞间、细胞与
间质、细胞与分子的相互作用有特殊意义，在机 体生理、病理过程中发挥重要的作
用。
唾液酸化修饰屏蔽了与之相连的糖蛋白及糖脂结构，稳 定细胞膜结构，提高了
热稳定性，并保护细胞和大分子不受酶及免疫系统的攻击，从而起保护细胞的作用 。
很多恶性肿瘤细胞和一些病原体则利用唾液酸修饰，逃避机体免疫监视和攻击。唾
液酸作为识 别为点，参与细胞识别及信息传递。唾液酸可被选凝素、唾液酸结合性
免疫球蛋白样凝集素家族等粘附分 子识别。也是一些信号分子、病原体如流感病毒
的作用位点。
表面唾液酸话使得细胞外表面带 负电荷，有利于与带正电荷的物质结合，从而
参与细胞水盐代谢、物质转运等生理过程。带负电荷的唾液 酸具有亲水性，在周围
形成很大的水合半径，造成细胞间距离的增加，并通过电荷排斥阻止分子间相互作
用，所以说唾液酸对分子间甚至细胞间的相互作用都有潜在的抑制作用
[
2
]
。这种
特性可阻止血红细胞的凝聚、粘附，有利于细胞的迁移，对于人体的生理活动、生
0 20
长发育有重要意义。
唾液酸化修饰是生命活动所必需的，有实验证实抑制唾液酸的生物 合成对幼鼠
是致命的
[
3
]
。唾液酸在脑中的含量很高，它能够促进 神经细胞的分化、发育和再生，
参与突出的传递，参与记忆和学习功能，机体发育阶段各种组织唾液酸表 达水平较
高。而在成年人的组织中则为低表达，如成年人组织中出现唾液酸化水平升高，则
提示 发生病变的可能。
2 胃癌
2.1胃癌发生的过程
胃癌是最常见的恶性肿瘤，我 国的病人主要以进展性胃癌为主，确诊时绝大多
数已经发生转移，这是造成治疗失败的主要原因之一。因 此，研究胃癌细胞的侵袭
转移机制，早期发现和预测癌的转移、观察治疗效果和评价预后是胃癌研究的重 要
内容。与大多数肿瘤相类似的是，胃癌的侵袭与转移机制也极其复杂，参入的因素
非常多，包 括与细胞质核有关的因素，细胞膜及表面结构的改变等，是一个多步
级联过程。其中主要包括以下步骤： ①癌细胞从原发灶脱落；②与细胞外基质
(Extracellular matrix，ECM)、基底膜(Basement membrance，BM)发生粘附并降解；
③穿越血管壁进入循环并到达远处部位；④肿瘤血管形成；⑤在继发部位不断增殖
形成转移灶。在这些多 步骤的动态、连续的侵袭转移过程中，癌细胞由原发灶脱落，
是肿瘤发生侵袭转移的始动因素
[
4
]
。
2.2胃癌的侵染、转移
肿瘤细胞游走性增加，即肿瘤细 胞之间及与周围组织粘附作用的减低是肿瘤细
胞由原发灶脱落的主要原因。而粘附作用的减低又主要与肿 瘤细胞表面糖蛋白糖链
结构的改变有密切关系
[
5
]
。细胞膜糖蛋白 是蛋白质和寡糖链(糖链)的共价复合物，
其糖链在维持细胞分化、功能和形态方面起着非常重要的作用 。一旦细胞膜表面糖
链结构发生异常变化，就预示着其基本的生物学行为发生了改变
[
6
-
9
]
，尤其在细胞
的粘附、运动、分子识别及细胞识别等基本功 能方面的改变，与肿瘤细胞的恶性增
殖和转移有直接关系陋
[
10
]
。因此，研究细胞膜表面糖蛋白及糖链结构变化对于揭示
1 20
肿瘤细胞的侵袭与转移是非常重要的。
胃癌致死率高的两个重要因素是胃癌患者确诊时多数处 于中晚期以及缺乏有
效的治疗手段。胃癌患者治疗失败和致死的主要原因就是肿瘤的侵袭和转移。胃癌< br>发生侵袭和转移是一个多基因、多阶段、连续复杂的过程，这一过程包括肿瘤细胞
从原发灶脱离， 穿越基膜及细胞外基质浸润迁移并进入血管，黏附于血管内皮，进
入循环系统并随血流到达远处，穿出血 管侵入细胞外基质并形成转移灶。癌细胞脱
离原发灶后，穿越组织屏障是转移的关键步骤。细胞外基质和 基膜(BM)是肿瘤生长
和扩散的自然屏障，细胞外基质(extracellularmatrix， ECM)主要成份由胶原、糖
蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即 以基底膜
@2usememmembranes，BM)的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织形式 存在[11]。
肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式
的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制
还不是十分清楚，但已 发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。肿瘤
细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘 附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解
基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶 性程度高的肿
瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前研究认为，
M MPs不但介导肿瘤细胞对宿主细胞外基质的降解，还控制肿瘤新生血管的生成，
影响细胞黏附分子的功 能及调控肿瘤细胞的生长等。而肿瘤血管生成是肿瘤生长和
转移所必须的，被认为是很重要的预后因素< br>[
11
]
。
3 唾液酸与肿瘤作用
3.1唾液酸与恶性肿瘤

有关恶性肿瘤与唾液酸关系的研究是从发现恶性肿瘤血清唾 液酸升高开始的。
早在1955年，Winzle等首次报道，恶性肿瘤患者血清唾液酸升高。上世纪七 十年代，
国外学者们通过动物实验及人体肿瘤研究，证实一些恶性肿瘤个体血清唾液酸水平
异常 升高。到上世纪九十年代，唾液酸开始作为血清肿瘤标志物用于临床。尽管血
清唾液酸水平升高的机制尚 未完全明确，但目前的研究普遍认为这是由癌变细胞过
2 20
表达的唾液酸大量脱落入血 所致。在一些非肿瘤性病变中，血清唾液酸也可能会升
高，如：感染、炎症等，但一般而言，其升高幅度 远较恶性肿瘤的为小，而且作有
效抗感染治疗后可下降至正常。众多的研究提示恶性肿瘤患者血清唾液酸 升高程度
较非肿瘤性病变的大，所以尽管血清唾液酸对恶性肿瘤的诊断并非特异性，但具有
较高 的敏感性，联合检测血清唾液酸及其他肿瘤标记物对恶性肿瘤的筛查、早期诊
断有很大的临床意义。 < br>有文献报道,血清唾液酸水平与肿瘤恶性程度、肿瘤临床分期相关,分化越低、
分期越晚血清SA 水平越高;作有效治疗后血清唾液酸可下降，肿瘤复发、转移后
又上升，提示血清唾液酸不但可作为恶性 肿瘤辅助诊断的指标，还可作为病情发展、
肿瘤消长的监测指标。然而，血清唾液酸检测并不是直接检测 细胞表面的唾液酸表
达情况，不能深入了解肿瘤细胞唾液酸表达的具体情况
[
12]
。
3.2唾液酸与胃癌
细胞癌变过程中常伴有细胞膜表面糖蛋白N-糖链结 构的异常改变，其中肿瘤
细胞表面唾液酸化水平增加与肿瘤的恶性进展及早期转移有密切联系。有关唾液 酸
在人胃癌细胞表面表达的特异性及其临床意义的研究，国内外相关报道较少。唾液
酸在胃癌细 胞表面的表达与胃癌侵袭、转移潜能之间的相关性，尚有待进一步研究
与探讨。利用能够特异性识别、结 合NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAcGlc唾液酸结构的朝
鲜槐凝集素，检测2,3唾液酸 在胃癌组织及其转移性淋巴结以及大肠癌组织中的表
达。
化学上，当糖链结构的末端连接上唾 液酸便意味着糖链延伸的终止。因此，唾
液酸一般是糖链末端结构。研究发现，SA是血清糖蛋白与糖脂 生物效应的重要成
分，在细胞的恶性转化中起特殊作用。而血清中存在一种新蛋白脂质，是含唾液酸的糖脂，是神经节甘脂的衍生物，而正常人缺少这种糖脂或含量甚微。这类糖脂结
合唾液酸的异常升 高与恶性肿瘤的发生密切相关。肿瘤细胞的转移和细胞表面糖复
合物的异常表达特别是糖复合物末端的唾 液酸化改变密切相关。
由于它位于糖链末端并携带负电荷，唾液酸对分子之间甚至细胞间的相互作用
3 20 都有潜在作用。一方面唾液酸可通过增加肿瘤表面负电荷和掩盖其表面抗原，从而
有利于肿瘤细胞在 血液循环中逃避宿主免疫细胞的杀伤；此外，唾液酸的聚积，能
够直接影响糖链分子的连接，增加细胞之 间排斥性，可使得肿瘤细胞之间及与周围
组织的粘附性降低，细胞容易由原发灶脱落而发生转移。 胃癌细胞表面异常唾液酸化的发生可能是由于,唾液酸转移酶表达水平增加或
活性增强，导致这种带 负电荷的,唾液酸糖链结构在肿瘤表面增加，从而使得肿瘤
细胞之间的粘附力减弱，转移能力增强。因此 研究其细胞表面糖蛋白糖链结构特点，
将有助于从新的角度探讨胃癌发病机制，为临床诊断及预测预后提 供实验和理论依
据。研究胃癌细胞表面MAL特异性识别、结合的糖蛋白糖链结构特点，有可能利用这些特异性糖蛋白作为靶点或抗原，研制、开发其抑制剂或单抗，通过对末端糖链
的修饰作用，消除 或降低肿瘤细胞的恶性转移或侵袭性能，为临床提供新的治疗方
法
[13]
。
4凝集素
4.1简介

凝集素是一类糖结合蛋白，广泛分布于各种有机体中 。凝集素的最大特点是能
专一的识别糖蛋白或糖脂中某一特定的单糖或寡聚糖中特定的糖基序列而与之结
合
[
14
]
。细胞膜及细胞浆内存在凝集素受体，正常情况下这种凝 集素受体相对稳定，
当细胞恶变时，受体的数量和性质随机改变。利用凝集素具有与特定糖基转移性结< br>合的特性，将其作为分子探针检测肿瘤细胞表面及细胞内糖基受体的分布，研究肿
瘤细胞的恶性进 展和侵袭、转移情况，对于肿瘤的早期诊断、监控肿瘤进展及评价
预后具有重要的临床价值
[< br>13
]
。
4.2 MAL简介
植物凝集素MAL是从植物朝鲜槐的 种子中提取的一种糖结合蛋白，是一种有
效的淋巴细胞有丝分裂促进剂。研究发现MAL对NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAcGlc这一
完整的三糖结构具有特异性识别与结合作用，且MAL仅能 够识别N-型糖链的末端
唾液酸，MAL仅对胃癌细胞表面糖链结构有特异性结合反应，而在正常胃粘膜 细
4 20
胞表面无MAL识别的糖蛋白糖链结构NeuAc 2,3Gal1,4Glc NAcGlc的表达
[
15
、
16
]
。近
年来被广 泛的应用于检测和分析肿瘤细胞表面唾液酸水平的改变。
4.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记
胃癌细胞表面存在MAL特异性识别并结合的NeuAc 2,3Gal1,4NAcGlc糖链结构，且这一糖链结构仅存在于胃癌组织的细胞表面，在正常胃粘膜细胞表面无表达。
此外，2,3唾 液酸与胃癌的侵袭深度及淋巴结转移有显著相关性。胃癌细胞表面出
现的这一唾液酸水平的改变以及这种 改变与胃癌侵袭、转移潜能之间的相关性，其
生物学机制迄今仍然未知，国内外文献对其亦鲜有报道。在 目前研究中，检测了几
种胃癌细胞表面2,3唾液酸的表达水平，并对其表达与胃癌细胞的侵袭、迁移潜 能
之间的相关性做了进一步研究。2,3唾液酸在三种不同胃癌细胞表面的表达存在差
异，且均 显著高于正常胃粘膜细胞。此外，细胞表面唾液酸化水平最高的C-7901
表现出更强的与人工基膜M atrigel的粘附能力和侵袭、迁移能力。













5 20
第二部分 课程设计部分

侵袭、转移相关性的研究

胃癌 是消化道最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发展迅速、死亡率高的
特点。在我国许多地区的恶性肿 瘤死亡统计中，胃癌多居前位，往往一经发现已经
处于中晚期，失去了手术根治的机会。因此，早期发现 和科学诊断胃癌的发生是胃
癌研究的重要内容。胃癌的的侵染、转移成为胃癌疾病研究的一个重要方向。 研究
表明胃癌细胞的转移主要是因为肿瘤细胞游走性增加，即肿瘤细胞之间及与周围组
织粘附作 用的减低是肿瘤细胞由原发灶脱落的主要原因。而粘附作用的减低又主要
与肿瘤细胞表面糖蛋白糖链结构 的改变有密切关系
[5]
。其中肿瘤细胞表面唾液酸化
水平增加与肿瘤的恶性进展及早 期转移有密切联系。有关唾液酸在人胃癌细胞表面
表达的特异性及其临床意义的研究，国内外相关报道较 少。所以本实验通过用凝集
素对胃癌细胞表面唾液酸的检测，细胞粘附性检测和胃癌细胞在重组基底膜中 的转
染来研究唾液酸与胃癌细胞侵染、转移的相关性，为研究胃癌药物研究提供理论基
础。









胃癌细胞表面,唾液酸糖链表达与其
6 20
1材料
1.1细胞株及细胞培养

人中分化胃腺癌细胞SGC-7901以 及人低分化胃腺癌细胞BGC-823由中科院上
海细胞生物研究所提供。人高分化胃腺癌细胞MKN- 28和人正常胃粘膜细胞GES-1
由北大医学部细胞生物学教研室提供。SGC-7901、BGC- 823和MKN-28生长于含
1096小牛血清的RPMI一1640培养液中，GES-1生长于含 1096胎牛血清的高糖
DMEM培养液中。
1.2试剂

药品

生物素标记MAL(Biotin-MAL)

小牛血清白蛋白
辣根过氧化物酶(Horseradish
厂家

Vector，美国

北京中山生物科技有限公司
peroxidase，HRP)标记链霉卵白素 北京中山生物科技有限公司
苏木素
DMEM培养基
RPMI 1640培养基
胰蛋白酶
, sialyllactose
新生小牛血清
胎牛血清
DAB显色试剂盒
Matrigel
纤粘连蛋白(Fibronection，FN)
结晶紫
Transwell小室
96孔、24孔培养板

7 20
福州迈新生物技术开发有限公司
Gibco，美国
Gibco，美国
Gibco，美国
Sigma，美国
兰州民海生物技术有限公司
JRH bioscience，澳大利亚
北京中山生物科技有限公司
Becton Dickinson，美国
北大医学部病理学教研室
中国远航试剂厂
Corning Costar，美国
Corning Costar，美国
异硫氰酸荧光素标记MAL laboratori es，美国
1.3试剂配制
1.3.1 D-Hank’S液配制
NaCl 8.0g
KCl 0.4g
Na
2
HP0
4
．12H
2
0 0.12g
KH
2
P0
4
0.06g
无水葡萄糖 1.0g
双蒸水加至 1000ml
将上述溶液用 NaHCO
3
。调节pH至7.2-7.4，分装，于121℃高压蒸汽灭菌30，-20℃< br>以下冰冻保存。
1.3.2 0.25%胰蛋白酶溶液配制
胰蛋白酶粉 2.5g
D-Hank’S液加至 1000ml
将 上述溶液用NaHCO
2
。调节pH至7.2.-7.4，用0.22um微孔滤膜滤过除菌，
无菌分装，-20℃以下冰冻保存。
1.3.3 0.4%台盼蓝溶液配制
台盼蓝粉 0.4g
PBS液加至 l00ml
将上述溶液加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。
1.3.4 0.1%结晶紫溶液配制
结晶紫粉 0.1g
20%甲醇溶液加至 l00ml
将结晶紫粉完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。
1.4仪器设备
仪器 厂家 型号
倒置显微镜 NIKON，日本 ECLIPSE TE2000一S
倒置生物显微镜 重庆光学仪器厂 XDS-1B
二氧化碳培养箱 美国SHELLAB 2406-2
8 20
多功能酶标仪 广州云星科学仪器有限公司 LB940
电子恒温水浴锅 黄骅市卸甲仪器厂 DZKW-C
电热干燥箱 青岛铁器二厂 Te202-1
净化工作台 苏州净化设备厂 SW-CJ一2F
立式压力蒸汽灭菌器 上海中安医疗器械厂 LDZX-50KBS
电子分析天平 Shimadzu，日本 AWl20
托盘式扭力天平 上海第二天平仪器 TN-IOOB
湿盒 北京中山生物科技有限公司
2方法
2.1 MAL细胞化学染色
2.1.1 细胞玻片的处理
将盖玻片置清洁液中浸 泡过夜，自来水冲洗20遍，双蒸水冲洗3遍，烘干后高
压消毒，然后放入24孔培养板内备用。
2.1.2 细胞消化
取指数生长期细胞，PBS洗细胞两次，用0.25%胰蛋白酶消化， 加入含10%小
牛血清的RPMI 1640培养液或含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，轻轻吹打成单
细胞悬液。
2.1.3 接种、染色
调整各细胞浓度为1×10
5
m1，接种于载有盖 玻片的24孔板内，每孔接种lml，
每种细胞设3个复孔，置37
0
C、5%C0< br>2
培养箱内常规培养。待细胞爬满盖玻片后，
从培养箱内取出培养板，PBS洗3次，每 次3分钟，4%多聚甲醛固定30min。将盖玻
片浸入到0.75%H
2
0
2
PBS溶液中，37
0
C孵育3分钟，以阻断内源性过氧化物酶。PBS
洗 ，每张盖玻片滴加1%BSA 50 ul，37
0
C孵育30min以消除非特异性染色。弃 去BSA
溶液，每张盖玻片滴加50 ul Biotin-MAL(4 pgm1)，37
0
C孵育1h。PBS液振洗，
每张盖玻片滴加HRP标记的链霉卵白素，室温孵育30min。 滴加DAB显色剂，显微
镜下观察显色情况。水洗，苏木素复染，流水冲洗3min，以洗去未与组织结 合的染
液。盖玻片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照：用PBS
9 20
缓冲液代替Biotin-MAL，其余步骤不变。
2.2.4 结果判断及分析 < br>显微镜下观察并拍照(×400)，以细胞膜或细胞浆内出现棕黄染色者判断为阳
性。按照上、下 、左、右、中五个视野分别计数总细胞数和阳性细胞数，计算不同
细胞株MAL的阳性率。
. 体外细胞粘附试验
在96孔板中分别加入含Matrigel 2ug的RPMll640培养液50 u1，抽气干燥备用。
每孔加入含3%BSA的无血清培养液20u1，37
0
C孵育 1h。每孔加入200u1PBS，振摇
冲洗10min。弃去PBS，每孔加入50u1 0.04% 结晶紫染液，静置20min。弃去结晶紫
染液，PBS洗三次以去除剩余染液，显微镜观察并成像(× 200)。每孔加入10%冰醋
酸100u1抽取结晶紫染液10min，于多标记分析仪560nm处 检测吸光度值。
. 重组基底膜侵袭实验
2.3.1 包被基底膜
Transwell 小室上室面包被Matrigel 5ug，在下室面铺10u1FN，4℃风干。
2.3.2 水化基底膜
每个小室加入2 50u1预温的含1%BSA的无血清培养液，37℃孵育30min，使基
质胶水化，弃去剩余培养液 。
2.3.3 接种细胞
制备细胞悬液前先将细胞撤血清饥饿12d,时，进一步去除血清的影响。
取胃癌细胞,台盼蓝染色,检查活细胞比例为95%以上。将细胞悬浮于含
0.1%BSA- RPMI 1640培养液中。调整细胞浓度为1×10
6
ml。将细胞悬液加到
Tr answell小室，每小室100ul，每种细胞设三个复室。将24孔板各孔内加入600ul含
0 .1%BSA的RPMll640培养液，将小室浸入含有培养液的24孔板中，置于5%CO
2
培
养箱内，37℃常规培养8d时。
2.3.4 细胞染色
取出小室，用棉签仔细擦去Matrigel基质胶和上室面未侵袭的细胞。以4%多聚
10 20
甲醛固定20min ，0.1%结晶紫染10min ，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用
中性树胶将膜封于载玻片上。
2.3.5 穿膜细胞计数
显微镜观察并成像(×400)，计数10个视野侵袭细胞的数量，取其平均值为每种细胞的侵袭转移数量。
2.3.6 统计学分析
采用单向方差分析评价体外细胞粘附 实验及重组基底膜侵袭实验结果，
SPSSl1.O统计学软件进行分析。
3 设计
3.1 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其转移能力的相关性

胃癌细胞表 面,唾液酸的检测。高度分化、中度分化、低度分化的胃癌细胞和正
常胃癌细胞进行实验，将实验分为4 组，每种细胞作为一组，用Biotin- MAL对细
胞进行侵染，在显微镜下进行观察。用PBS液代替Biotin-MAL对细胞进行侵染，
作为阴性对照组，其他条件不变，统计出各种细胞的MAL阳性细胞数，计算出各
种细胞的MA L阳性细胞率。
实验分为4组，将四种细胞在RPMll640培养液培养一定时间，用结晶 紫染色，
在显微镜下进行观察，并用分光光度计检测出各种细胞的吸光度，来区分他们与
EMC 的粘附能力。粘附能力强的转移能力强，通过两个实验的结果对比分析，看,
唾液酸在不同胃癌细胞表面 的表达与ECM粘附能力是否有关。
3.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性

实验分为四组，用重组基底膜接种四种细胞，将重组基底膜放到培养基中进行
培养一段时间，在显微镜下进行观察，统计出细胞的转移数目。用不同种细胞的转
移数同上述MAL细胞 化学染色的结论进行对比分析，看,唾液酸与胃癌细胞侵袭是
否有关。

11 20
4 总结
胃癌细胞表面唾液酸的检测选用MAL凝集素是因为MAL对
NeuAc ,Gal1,4Gl cNAcGlc这一完整的三糖结构具有特异性识别与结合作用，且
MAL仅能够识别N-型糖链的末端 唾液酸，MAL仅对胃癌细胞表面糖链结构有特异
性结合反应，而在正常胃粘膜细胞表面无MAL识别的 糖蛋白糖链结构NeuAc , Gal
1,4 GlcNAcGlc的表达，能够明显的区分出胃 癌细胞和正常细胞。所以凝集素的
选用非常重要。此结果还可以通过用流式细胞仪进行检测。
唾液酸在胃癌细胞表面特异性表达，对胃癌细胞的侵袭、转移非常重要。通过
用体外粘附能力的测定来测 定细胞的转移的能力。体外细胞粘附实验测定的为细胞
和之间的粘性，粘性越大细胞随的流动能力强，细 胞的转移能力就会增加。
胃癌细胞的侵染是侵染其它细胞，穿过其它的细胞膜，所以细胞的侵染能力的
测定过程中模拟细胞的生理环境非常的重要，因此选用基底膜的包被，此实验对基
底膜的选用和 处理非常重要。
5 设计体会
本次课程设计我选择的设计题目是《胃癌细胞表面2,3唾液 酸糖链结构的高表
达及其与胃癌细胞的转移的相关研究》 ，课程设计期间，紧张而充实，我们查阅资料文献、阅读文献、提出自己的设计方案、撰写设计论文、修改实验论文……在
此期间虽然遇到很 多的问题，但是我们从中也学习到了很多关于癌症的相关知识。
我之所以选择胃癌细胞的相关问题为这 一设计课题是因为现在胃癌是消化道
最常见的恶性肿瘤之一。在我国许多地区的恶性肿瘤死亡统计中，胃 癌多居前位，
我们周围就有很多胃癌患者，而胃癌之所以很难治愈是因为胃癌的起病隐匿，一般
发现症状很多都是胃癌晚期不再适合做手术，无法医治，而且胃癌的发展非常迅速，
死亡率高，而癌症的 最大问题所在是因为胃癌细胞的扩散问题。通过查阅资料，我
了解到胃癌细胞的侵染、转移的研究是一个 潜在的研究方向。在设计过程中我遇到
了几个难题，目前国内有关癌症转移的为题研究还不是很明确，参 考资料还不是很
多。后来随着参考资料的进一步阅读和理解，还有和同学的讨论，最终提出和完成
了自己的设计方案，此外在设计过程中和设计方案的书写过程中也遇到了问题，在
12 20 什么是方法什么是设计，方法和设计之间有什么区别，该如何书写方法和设计，这
一问题让我很伤脑 筋，最终通过和同学的讨论决定用本设计的书写方式。在书写论
文的时候在排版格式和内容上和老师所给 模板有所出入，经过再三的修订最终定
稿。
如今，这门课程马上要接近尾声了，看着自己这些 天通过奋斗设计的成果，在
欣慰的同时也认识到自己的不足。这门课程设计对我来说是一次学习和提高的 经
历，他将会激励我今后更加努力得学习和丰富自己。在此次学习课程中，我将以往
那些学到的 专业知识得意加强和综合，更有助于我们下一步的学习。这次课程设计
不仅提高了我的专业知识，提高自 己的思维动手能力，同时也提高了我的计算机水
平。这次课设对我来说是一个非常难得的学习机会，对此 我非常感谢学校给我们开
设了这门课程和赵红卫老师对我们的悉心指导，让我受益匪浅。也感谢我的同学 在
我设计过程中给予的帮助和支持，在此对他们表达我真挚的谢意！







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