和空姐同居的日子续基因治疗血友病指南

2020年11月17日发(作者：饶博生)

血友病的基因治疗概述

血友病分为遗传性血友病和获得性血友病。前者 是一组先天性单基因遗传性
凝血因子Ⅷ(FⅧ)、IX(FIX)或者Ⅺ(FⅪ)缺乏而导致的凝血功能 障碍的出血性疾
病，而后者一般同时缺乏2种或者多种凝血因子，常继发于肝炎、肝硬化、肝癌
转移等肝脏疾病，某些血液病(如急慢性白血病)、淋巴瘤、系统性红斑狼疮、类
风湿性关节炎和尿毒症 等。我们主要就就遗传性血友病(简称血友病)的基因治疗
作一综述。
1血友病的机理及传统治疗方法
血友病特点为早年发病，轻微外伤或小手术后的持续反复甚至 自发出血，多有家
族史并多发于男性。根据凝血因子所缺乏的种类可以分为血友病A(FⅧ缺乏)、血友病B(FIX缺乏)和血友病C(FⅪ缺乏)，血友病A约占血友病的85％，血友病
C在临床 上比较罕见，血友病A、B均为X染色体隐性遗传，而血友病C则为常
染色体不完全隐性遗传。血友病的 基础研究(包括血友病相关凝血因子的SNP、
STS、STR等多态性位点)已经比较成熟，其基因突 变有着高度的异质性，包括基
因缺失、异常基因片段的插入、基因片段的重排和点突变等。对于小片段的 缺失、
插入和点突变来说，血友病的严重程度取决于该突变所在结构域的功能，但也有
极少数血 友病患者编码区及其旁侧序列并未发生突变。在FⅧ等凝血因子的转运
过程中，许多蛋白质也参与其活性 、非活性形式转换的调控，编码这些蛋白质基
因的突变也会引起血友病样症状的出现。
随着发 病率较高的疾病得到越来越好的诊治，以前被人们认为发病率较低的血友
病，因其严重威胁着血友病患者 的生活质量而越来越受到重视。目前血友病的传
统疗法主要有替代疗法(对症补充血浆制剂和凝血因子浓 缩制剂)、重组凝血因子
疗法[3]和预防疗法等。替代疗法中患者会产生相应凝血因子的抑制物而抵消
3O％甚至更多的凝血因子活性，且存在传播病毒的危险。针对传统的浓缩或高纯
凝血因子所产 生的抑制物，临床上有采用猪FⅧ浓缩制剂来解决，因为猪FⅧ与
抑制物的亲和力比人FⅧ要高的多；另 外，绕过内源性凝血途径利用FⅧ旁路制
剂(凝血酶原复合物(PCC)和激活的凝血酶原复合物(AP CC))也可以促凝；目前有

1种新的旁路制剂，即重组活化的FⅦ(rⅦa)，由于它的酶 促反应局限在细胞表
面，所以大大降低了全身凝血活化和血栓并发症等副反应，其高效性和安全性已得到认可；但是高昂的治疗费用及副作用，使猪源性FⅧ及rFⅦa的应用均大打
折扣[4]，通过 基因工程方法生产的重组凝血因子虽然减少了传播病毒的危险，
可也存在一些副反应(第1、2代制品) 和理论上的危险[5]。预防疗法则主要是针
对降低血友病发病率、提高患者生活质量而采取的措施。此 外，中医药在血友病
治疗上也取得了一定的进展，北京椿树医院血友病治疗中,6E报告了他们对424
例血友病(A型、B型)患者采用中药治疗的情况，结果比较乐观，但相关的项目
监测还有待进 一步证明。以上疗法均需终身治疗且收费昂贵，因此血友病被形象
地称为“贵族病”。基于传统治疗的缺 点，2O世纪中末期兴起的基因治疗在血
友病治疗领域的研究备受关注。
2血友病基因治疗
基因治疗是一种以改变基因表达为基础的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病
的方法，它通过基 因工程的实验手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因缺陷
的患者体内，使导入的基因发挥作用或使 缺陷基因在原位得以校正和修复，从而
纠正基因缺陷导致的各项异常表现。自1979年被首次运用于疾 病治疗研究以来，
基因治疗经过了准备期(1980—1989年)、狂热期(1990—1995年) 和理性期(1996
年至今)3个阶段[7]，这其问，因其所引发的毒副反应以及生殖细胞水平的基因
治疗所涉及的一些伦理问题，曾一度处于停滞状态。国内自薛京伦等[8于1991
年首次开展 血友病基因治疗以来，血友病的基因治疗受到了广泛关注，并于2O
世纪末期有了长足进展。
血友病所以成为基因治疗研究的首选在于：1)血友病系单基因造成的凝血紊乱，
基因水平上的发病机制 已较为清楚，如FⅪ基因突变的相关数据库已建立(http：
／／www．fac—torxi．or g)。较之以前在血友病相关凝血因子基因、蛋白结构
及其功能上的研究，近年来有不少学者致力于研究 患者血小板聚集率以及FⅧ基
因表达的调控[9]。2)正常血浆中凝血因子的含量很少[(g—mg) ／L]，并且约正
常凝血因子浓度的1O就可以维持正常凝血，而对于FⅧ缺乏患者来说，1％一5就能维持正常凝血[1。3)凝血因子在血浆中的水平没有很严格的调控，凝血因子
在正常人群中的 范围跨度较大，FⅧ、FIX的正常上限可达150。4)除肝脏能产生

凝血因子外，其它一 些器官也能产生，靶器官的可选择范围较宽。5)凝血因子的
相关基因已经克隆分离。6)构造动物模型 时可选用体型较大的动物(如狗)，与人
体环境较为相近。腺病毒载体于上世纪9O年代开始应用于人体 内的基因治疗，
在以小鼠、狗和猴子等动物为模型的实验中，均成功地表达了凝血因子并纠正了
凝血紊乱的表型，这都显示出血友病基因的希望。随着载体在基因治疗中的重要
性被人们所认识，载体的 开发和改造也进一步深入和拓展，尤其是重组腺病毒的
使用，使血友病的基因治疗有了可喜的前景Il。 迄今为止，虽然尚无1项动物
实验得到凝血因子终生持续表达的阳性结果，但长达几年的表达效果已显示 出其
巨大的潜在价值。1994年的首次临床实验方案采用了逆转录病毒载体途径；1995
年 则以人皮肤角质细胞为靶细胞，以鼠科白血病病毒为载体，将FIX的cDNA转
入角质细胞中进行培养 ，结果外源基因稳定地整合到了角质细胞的染色体上。目
前国际上关于血友病基因治疗的临床实验正在如 火如荼地展开，GenStar公司研
制的MAx—ADFⅧ腺病毒载体由1种普通的感冒病毒改造而成 ，该载体中所有与
递呈病毒相关的基因都被编码FⅧ的基因所替代，目前MAX-ADFⅧ已进入临床试
验阶段Il。Avigen生物技术公司用于治疗血友病B的Coagulin—B(TM)基因疗法通过肌内注射给药，临床试验进展良好，并已申请新药调查。我国在此研究领
域起步较早，薛京伦 等Il。]在国内首先开展了血友病B基因治疗研究，以皮肤
成纤维细胞等为靶细胞，采用逆转录病毒、 腺病毒及其相关病毒等介导的基因转
移方法，作了人FIX的离体表达、动物试验和安全性检测等一系列 研究，并早在
1993年就进行了血友病B成纤维细胞的临床I期基因治疗试验，该课题组研制
的AAV2一hFIX注射液已经获得国家食品药品监督管理局的药物I期临床研究批
文，标志着我国血 友病基因治疗已获得突破性进展。
3血友病基因治疗的影响因素及对策
目前影响基因治疗效 果的主要因素包括载体引起的免疫反应、载体的安全性和外
源基因不能持续高效表达等，解决的途径主要 是选择合适的载体类型、适宜的载
体剂量、载体进入宿主的途径以及特异性的靶器官等，除此之外，治疗 时机的把
握、患者情况的确认以及细胞因子对转入基因启动子的影响等也应考虑在内。
3．1 载体的类型主要分为病毒载体和非病毒载体，目前应用较多的是病毒载体。
每种载体都有不同的应用对象 ，并且各有其优缺点。一般来说，AAV病毒[2]和

逆转录病毒所引发的副反应要弱些，而 腺病毒载体则较强[2，但也有研究显示，
由逆转录病毒介导的基因治疗所诱发的致癌风险远比预期的要 高；此外，所引发
免疫反应的强弱与质粒DNA中GpC模块的含量及其甲基化程度也有关。如何改造< br>载体值得高度重视，目前主要是改变病毒载体的衣壳结构，修饰或尽可能削减病
毒的编码基因]。 有研究用血清型为2／5／6／8的AAv-cFⅧ载体对血友病小鼠
和狗进行基因治疗，经过长时间的 观察后发现，以血友病A小鼠和狗为动物模型，
分别应用血清型为6／8和2／6／8的AAV—cFⅧ 为载体，均持续表达了治疗活
性水平的FⅧ，并且在长达3年的时间内没有检测到抗体或其它相关的毒性 。目
前一些特异性细胞靶向载体、新病毒或非病毒载体的开发正在有条不紊地开展。
Essne r等认为沉默的转座子可能成为以染色体为靶目标的非病毒载体，并且已
有一系列针对血友病和I型糖尿 病等疾病的试验结果表明转座子系统确实效果
良好，相关研究现主要集中在靶位点的选择和插入后突变的 形成等方面，它可能
成为比病毒载体更安全可靠的另一种基因治疗途径。关于腺病毒依赖性辅助病毒的研究结果也比较乐观，这种病毒几乎缺失所有的病毒编码顺序，只产生很小的
免疫反应以及几乎可 以忽略的副反应l_2。Moayeri等[。。]利用逆转录病毒载
体使造血干细胞表达转入的FⅧ， 并待诱导免疫耐受后将造血干细胞移植人小鼠
体内，在实验的6个月中凝血因子持续表达(正常血浆的1 1)，并只检测到极少
量的FⅧ抗体。
3．2载体的剂量及进入宿主的途径不管是通过自体( 直接体内)还是回体(间接体
内)途径进入宿主，诱导产生免疫反应的细胞因子取决于载体的剂量。通过 肝脏
途径向小鼠体内注射大剂量的AAV一Ⅸ载体会引发对转入基因表达产物的耐受，
通过肌肉 注射则会产生FIX抗体，而使用低剂量的载体可避免对AAV病毒衣壳产
生的特异性体液免疫反应，此 外，转入基因的表达水平也可能影响免疫耐受。有
研究对狗和大鼠通过骨骼肌注射包装有凝血因子FIX 的AAVs，结果FIX的表达
持续稳定，且未检测到FIX抗体，免疫反应较弱，这可能与其诱导产生 TGF—B
和其它组分的CD4T细胞有关[3。也有研究将整合有外源基因的细胞装入经磁化
处理的铁磁流体藻酸盐微胶囊中，分别输给患有血友病等疾病的小鼠，结果证明
这种基因治疗方法效果较 好，再通过核磁共振成像(MRI)对小鼠体内微胶囊进行
追踪和尸解，发现微胶囊具有良好的渗透性和 生物适应性，这为人类基因治疗中

免疫隔离方法的应用提供了有利的依据[32]。另外，C ao等I33研制了预防免疫
反应的草案：预先在血友病B小鼠的鼻腔内，用含人FIX特异的CD4T 细胞抗原
决定簇反复处理，同时在将小鼠的FIX基因敲除后，利用腺病毒介导转人人FIX
至 肝脏，即可诱导产生人FIX的IgG。结果显示经鼻腔处理的小鼠，其产生的抑
制物大为减少，且体内 FIX水平较恒定，基因敲除小鼠的部分凝血紊乱也得到持
续纠正，这种免疫偏差是由IL-10和TG F-~的升高、CD4CD25T细胞调控机制的激
活引发了T辅助细胞的一系列反应而造成的。 3．3靶(细胞)器官的选择目前血友病基因治疗的靶细胞主要是皮肤成纤维细胞
和肝细胞。有研究 对2条患血友病B狗的静脉注射辅助依赖性腺病毒载体(携带
含FIX开放读框基因)，注射后2条狗的 凝血时间从>60min下降到≤20min，并
且在没有明显抑制剂产生的情况下分别持续了604和 446d，这是此种载体在较
大型动物上首次实现的长时间的表型纠正，虽然有几项实验指标异常，但尚 未发
现毒副作用]。
3．4基因治疗的时机基因治疗的时机对疗效的影响目前尚未达成共识。 Xu等[35]
的1项研究以新出生的血友病A小鼠和狗为模型动物，用与治疗无关的序列逆转
录病毒为载体(如敲除了Ⅷ基因的B结构域等)作基因治疗，结果检测到动物体内
血浆FⅧ：C达到了正 常动物(139±22)和(116士5)的活性值，且保持了1．5
年；凝血试验结果正常且未发现抑 制因子，说明新出生的小鼠和狗所接触到的相
关危险因素较少，因而存在的影响抑制因素也较少，新生儿 期也应是基因治疗的
适宜时机；对新生儿肝脏的基因治疗的研究结果显示，治疗后新生儿能持续分泌FⅧ，且治疗相关免疫副反应大为减少，这使得动物试验结果在人体试验的水平
上得到了进一步的支 持。另1项在母亲妊娠后期对基因缺陷确诊胎儿基因治疗的
研究表明，该治疗的器官靶向性很强，这是在 婴儿、青少年或成年时期的治疗所
不能比拟的，该实验利用超声导向将包装有牛乳糖报告基因和FⅨ的腺 病毒载
体，从脐静脉进人胎儿的胎肝，随后转人的基因表达产物通过PCR、PT-PCR免疫
组织化学法检出Es6]。但是也有人认为在胎儿期进行基因干预，会避免一些早
发型的严重表征出现。 对此，Coutelle等[3]用2年时间以小鼠为模型动物对胎
儿血友病B作了基因治疗，发现小鼠 在出生后都显示了较好的治疗效果，然而伴
随着治疗却产生了发生率很高的肝癌并发症。这为基因治疗越 早越好的观点提出

了一个较有力的反证。
3．5患者的情况患者暴露于危险因素的 早晚会影响血友病的轻重程度，研究表
明如果宿主在早期就感染过野生型AAV或AV，那么应用相关载 体的基因治疗所
引发的免疫反应会更强烈l3。当在小鼠中转人包装有人类基因的载体时，小鼠
所产生的免疫反应因其遗传背景而异[3。此外，1项AV- LacZ载体介导的由上皮
细胞转导的实验表明IFN一．y、IL- IO会下调启动子的活性，而TFN- AIL-I~和
IL-4会上调启动子的活性，因此细胞因子对转人基因启动子的影响也不可忽视。
4展望
虽然肿瘤等发病率较高的疾病在目前是基因治疗研究的热点。但是基因治疗作为
肿瘤治疗的手段之一尚不成熟，将血友病这种有典型意义的疾病作为模式是开启
基因治疗这扇大门的金 钥匙。科学正确地了解血友病的分子和细胞学病因，以及
导致出血表型的致病机理是基因治疗的基本前提 ，再加上近些年对凝血因子的基
础研究日臻完善。血友病的基因治疗也更加有的放矢。基因治疗在血友病 方面的
研究也会为凝血因子活性升高等其它凝血疾病。甚至肿瘤的治疗提供可借鉴的经
验。根据 历史的经验和教训，我们总结出正确对待基因治疗的思路是：重视基础
研究，包括选好靶基因、加强病毒 的生理周期、分子生物学与疾病发生发展的关
系等基础研究。结合化学、物理和材料科学等学科，拓展具 有实用性的病毒或非
病毒型载体并加以有效地改造；深人研究各种疾病的整个病理生理过程；用细胞一组织一特异性启动子介导基因进人特殊类型的细胞，发展更多的基因转导动物
模型；此外，在整个 基因治疗过程中，全面、客观和正确的评价也是十分重要的，
既要认识到基因治疗的巨大潜值，也要充分 认识到其危险性，只有这样才能更快
更好地完成血友病乃至多种疾病基因治疗的攻关任务。