血精灵猎人平潭万基医学检验所胎儿亲子鉴定报告

2020年10月25日发(作者：曾志)
平潭万基医学检验所无创胎儿亲子鉴定研究报告
摘要
目的：
该研究的目的是使用基于微阵列芯片的单核苷酸（SNP）多态性测量从母体血浆分离的cell
free DNA（cell free DNA）来评估基于信息学的无创性产前亲子鉴定（胎儿亲子鉴定）的诊
断准确性。
方法：
从21名成年孕妇（胎龄在6至21周龄）取血样，从相应的生物学父亲中取出遗传样品。
亲子 性通过在体外受精期间对婴儿的基因检测，受孕产品，受精控制和或植入前基因诊断
进行确认。使用Hu manCytoSNP-12微阵列芯片扩增并分析亲本DNA样品和母体无浆细胞
的DNA。基于信息 学的方法测量单核苷酸多态性数据，确认或拒绝亲子关系。具有足够胎
儿cell free DNA分数的每个血浆样品独立地针对确认的父亲和1,820个随机的不相关的男
性数据进行测试。
结果：
21个样品中有一个没有足够的胎儿cell free DNA。当对生物父亲进行 测试时，该测试正确
证实了其余20个样品（100％）的亲子关系，P值<10 -4。对于使用不相 关男性作为所谓
父亲的36,400次测试，99.95％（36,382）正确排除了亲子关系，0. 05％（18）是不确定
的。没有任何错误。
结论：
使用单核苷酸多态性微阵列芯 片测量的基于信息学分析的胎儿亲子鉴定在妊娠早期准确确
定亲子关系。
关键词：胎儿，无创，亲子鉴定，产前


介绍
可靠的产前亲子 鉴定需要直接进行绒毛膜取样或通过羊膜穿刺进行羊水取样，这两者都会增
加对母亲和胎儿造成伤害的风 险。羊膜穿刺术的流产风险为1 300-1 500（参考文献1），
其他并发症的风险很小。2 ，3绒毛取样进行了类似的流产风险和胎儿四肢减少缺陷的13000
的风险，尤其是当将10周妊娠之 前进行。4，5虽然美国妇产科学会建议将这些程序提供给
所有孕妇，1 当母亲处于遗传缺陷的高风险时，如积极的第一孕期筛查后，它们最常用。
母亲血液中胎儿cell free DNA（cfDNA）的发现表明可以开发胎儿亲子鉴定，这将避免与有
创操作相关的风险。 6虽然胎儿cfDNA在母体循环最初报道十多年前以上，6，7，8使用
孕妇外周血一种可靠的，非侵 入性的亲子测试的发展已经证明难以实现，因为胎儿cfDNA
通常包括在总cfDNA的<20％母亲 血浆并且高度分散。9胎儿cfDNA的有限数量及其通过
母体cfDNA的重度稀释存在重大技术挑战 。这些可以通过将微微阵列芯片或高通量测序（其
测量数十万至数百万个DNA片段）与复杂的生物信息 学技术结合以从母体血浆cfDNA测量
获得的有限胎儿基因型数据中提取最大信息来克服。
我们之前曾报道过这种称为亲本支持的方法，该方法使用来自母本和父本DNA的单核苷酸
多态性（SN P）芯片测量来提高噪声胚胎DNA基因型测量的保真度。10虽然这种方法精确
地在单个胚胎细胞的所 有24条染色体倍性标识，它并没有被用于亲子鉴定。
在这里，我们使用家长支持算法的一个版本来确定从母体血浆分离的cfDNA所做的cfDNA SNP测量的胎儿组分是否可能是由于所谓的父亲造成的。我们报告了21名孕妇测试这种新
方法的 结果，每个样本独立测试了确认的父亲以及1,820名无关个人。我们在怀孕6周后
就能以100％的 准确性鉴定亲子关系。
去：
材料和方法
入选妇女夫妇的纳入标准是在已知亲子关 系的第一或第二个妊娠期的单胎妊娠。夫妻通过
体外受精诊所，产科办公室或在线广告进行登记。所有符 合纳入标准的女性都在2011年4
月至6月期间入组。妊娠年龄介于6至21周，并且以各种方式证实 了亲子关系（表1）。
21个样品中的9个在体外通过控制受精已知亲代受精，并通过基因型特异性植入 前基因诊
断再次确认了亲子关系。剩余的12份样本通过独立的亲子鉴定对胎儿或出生后遗传物质
（DNA Diagnostic Center，Fairfield，OH）进行了亲子鉴定。所有参与者 均获得书面知情
同意书，并在机构审查委员会批准的研究协议下收集遗传样本。
表格1

亲子鉴定包括用于验证试验的样本类型
将母体血液样品（?20ml）收集到无 细胞血液试管（Streck，Omaha，NE）中，并且将血
液样品（?5ml）收集到EDTA血 液收集管中。平均来说，10毫升血浆从每个母体样品通过
双离心（分离1,600 克 10分钟，管 传递，离心16,000个克10分钟）。根据制造商的说明
使用Qiagen（Valencia，C A）循环核酸试剂盒分离母体血浆cfDNA并在45μl缓冲液中洗
脱。使用20μl在1x NEB4缓冲液，0.42mmol l dNTP和2.5U T4 DNA聚合酶（New England
Biolabs，Ipswich，MA）中的20μl洗脱液在20℃下孵育DNA 末端30分钟，并使聚合酶
通过在75℃孵育15分钟而变性。加入3微升连接混合物（0.5μl10 x NEB4,1μl10mmol l
三磷酸腺苷，1μlT4多核苷酸激酶（New England Biolabs），0.5μlT4 DNA连接酶（New
England Bi olabs）），并孵育样品在16℃24小时，然后在75℃15分钟。将测试样品转移至
标准Ill umina Infinium测定（Illumina，San Diego，CA），如同母本和所谓的父本 基因组
DNA样本一样。简而言之，将24μlDNA在37℃下全基因组扩增20-24小时，然后进 行片
段化和沉淀。除非另有说明，所有后续程序均在Tecan EVO（瑞士M?nnedorf）进 行。将
沉淀重新悬浮在微微阵列芯片杂交缓冲液中，热变性，并转移至Cyto12-SNP微微阵列芯
片。将微微阵列芯片在48℃孵育至少16小时，X染色（Infinium II Chemistr y），洗涤并扫
描。并转移至Cyto12-SNP微微阵列芯片。将微微阵列芯片在48℃孵育至少1 6小时，X染
色（Infinium II Chemistry），洗涤并扫描。并转移至Cyto1 2-SNP微微阵列芯片。将微微阵
列芯片在48℃孵育至少16小时，X染色（Infinium II Chemistry），洗涤并扫描。
使用BeadStudio（Illumina）软件提 取微微阵列芯片强度。通过考虑母亲纯合的常染色体
SNP来确定母体血浆中的胎儿部分。基于群体频率 ，母体纯合SNP组被分成子集，其中胎
儿极有可能或极不可能具有与母亲相同的基因型。胎儿分数与两 个子集之间观察到的非等位
基因强度的差异成比例。
使用家长支持分析基因分型结果。8对于 每个母亲和所谓的父亲组合，该方法生成一个检验
统计量，表明该可能父亲的基因型占母体血浆cfDN A基因型测量的胎儿组分的多少。测试
统计值是为5,000名不相关男性的母亲分别计算的，为这种情 况创建了一个不相关的男性测
试统计分布（图1和补充图S1-S19线上）。然后为母亲和被指称的父 亲计算检验统计量，
单假设拒绝检验确定所谓父亲的检验统计量是否落在使用无关男性产生的检验统计量 的分
布之下。如果所谓的父亲的检验统计量被排除在无关男性检验统计量分布之外，那么所谓的
父亲被确定为亲生父亲。如果所谓父亲的检验统计量落在无关男性检验统计量分布范围内，
则认定他不是 生父亲。


图1
亲子鉴定的父母支持方法。两个独立的女性的亲子鉴 定结果：（a）一个带有亲子鉴定和（b）
一个带有亲子鉴定排除。测试统计分布用灰色表示，该区域表 示父亲包含（指称父亲的P
值<10 -4）用绿色表示，指示父亲排斥的区域（所指称的P值> 0.02的父亲）用米黄表示，
并且该地区表明不确定的亲子关系（据称父亲的P值介于10 -4和0.02 之间）用黑色表示。
具体而言，根据无亲缘关系的男性分布的所谓父亲的检验统计量的P值<10 -4时，称为亲
子鉴定（确认亲子鉴定）。当计算出的P值在10 -4和0.02 之间时（图1），调用一个不确
定的结果（无呼叫）。当计算出的P时，称为父亲排除值> 0.02。 当母体cfDNA中的胎儿
DNA分数<2％时未做出决定。用于产生预期分配的一组无关个体由来自各 种种族背景的个
体组成，并且使用不同种族的不相关个体重新计算亲子鉴定，包括针对所指称的父亲指示 的
种族。包含和排除结果由信息学方法自动生成; 不需要人为判断。
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结果
使用家长支持测试了21个已知亲子关系的母亲血样（表1）。由于母体血浆中胎儿cfDNA
的比例很低（<2％，表1），因此无法评估一个样本。对于其余20份胎儿cfDNA充足的样
本，使 用确认的父亲和随机设置的1,820名无关男性个体进行了1,821次独立的亲子鉴定，
共进行了3 6,420次亲子鉴定。我们在100％（2020）的病例中证实了亲子关系，P值<10
-4（表1）。该测试早在妊娠6周时就准确鉴定亲子关系，并且胎儿cfDNA的含量较低。
值得注意的是，99.95％（36,382 36,400）的测试使用家长支持正确排除了亲子关 系。只
有18（0.05％）被称为不确定。没有一个测试样品的亲子鉴定不正确。
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讨论
我们报告了第一个高度准确，无创，临床可用的产前亲子鉴定。传统的产后亲子鉴定包括 分
析单串联重复序列并与所谓的父亲进行比较。由于大量完整的基因组子DNA可在产后获得，
测量结果稳健，只需15-20个单串联重复序列即可获得高度准确的亲子鉴定结果。11
在没有羊膜 穿刺术或绒毛膜绒毛取样的情况下，或者在孕前非常早期，用于确定产前亲子鉴
定的选项是有限的。虽然 从母体血浆中胎儿cfDNA被可靠地测量，12和各种团体已报道了
使用聚合酶链式反应，胎儿特异性 等位基因的扩增和检测13，14，15，这些方法不包括足
够的胎儿特异性等位基因准确地测量侍和不 适合扩大询问的基因座。
最近报道了30例使用cfDNA正确鉴定亲子关系的报道。16但是，这项 研究只对比已知的
父亲一个无关男性。如果真正的父亲不是这两个样本中的一个，那么这种方法可能会鉴 定出
一个人的亲子关系，这个亲子关系比另一个亲缘关系更密切，这是由于例如小的种族亚群的
亲缘关系密切。这强调了对大量无关男性进行检测的重要性; 在这项研究中，我们测试了
5000个随机个体。
更值得关注的是，他们没有报告每个测试的 准确性，而是报告了30个案例中正确猜测亲子
鉴定的机会，这是十亿分之一 - 通过正确猜测每个测 试的亲子鉴定的机会计算的数字12）
并将其提高到30次方（30次测试）。这种综合统计数据可能具 有误导性，并且在临床上无
用，因为每项测试都不需要非常精确，无法提供令人印象深刻的数字。例如， 假设每测试
99％的准确度（远低于99.99％的行业标准），正确猜测30次测试的总体机率仍然是 74％。
相比之下，假设使用家长支持计算每个测试的准确率为99％，那么正确猜测所有36,40 2个
呼叫的概率是10 158中的 1 。假设99.99％的准确度，典型的出生后亲子鉴定准确度 水平，
正确猜测所有36,402次呼叫的机会仍然只有2.6％。这表明家长支持方法准确度> 99.99％。
重要的是要注意一个密切相关的男性可能会返回一个假渊源。初步结果显示，有问题的 孩子
的祖父祖父或叔父返回测试统计数据，尽管比实际的父亲测试统计量小，但P值<10 -4（数
据未显示）; 出于这个原因，来自密切相关的所谓父亲的样本必须进行比较以确保正确的亲
子鉴定。
本文使 用的方法通过使用高通量SNP微阵列芯片测量常染色体SNP而避免了基于传统和
基于cfDNA的方 法的问题。血浆测量中存在大量的母体cfDNA，当从cfDNA确定胎儿基因
型时，这通常导致低信 噪比。识别母亲的基因型和胎儿分数使我们能够预测母体信号的数量
并相应地进行调整。尽管每个单独的 SNP测量都是有噪声的，但是将超过300,000个SNP
的数据聚合在一起允许高度准确的亲子鉴 定。该试验早在妊娠6周时就提供了准确的亲子
鉴定，胎儿cfDNA分数低至2.3％，这表明亲子鉴 定可以在妊娠早期进行，当胎儿分数仍然
非常低时。
这种方法适用于其他平台，如新一代测序 ，最近已用于识别母体血浆中的胎儿cfDNA。17
该研究采用大量平行测序方法对来自单个受试者的 母亲血浆cfDNA进行了测序，鉴定了整
个胎儿和母亲的基因组。包括父母基因型以组装胎儿基因组并 确定母本与父亲的SNP遗传，
而不是在统计亲子鉴定中; 该方法缺乏基于信息学的分析，这有助于我 们识别和排除亲子关
系的准确性，并且更加劳动密集，因此不能很好地用于临床应用。此外，母体单体型 是从绒
毛绒毛取样推断的，因此否定了无创性检测的优点。我们目前正在尝试使用新一代测序来验
证家长支持的有效性。
总之，我们报告了一种高度准确的无创临床可用的产前亲子鉴定。需要进行更 大规模的研究，
以准确确定这种方法在妊娠早期如何识别亲子鉴定并确认更大队列中的疗效。