卵泡破裂降血糖动物实验

2020年10月23日发(作者：黄圣依)
辅助降血糖作用检验方法
1动物实验
1.1动物选择
选用健康成年动物 ，常用小鼠（25±2g）或大鼠（180±20g），单一性别，大鼠每组8-12
只、小鼠每组10 -15只。
1.2材料
1.2.1试剂
四氧嘧啶（或链脲霉素）小鼠（）、大鼠
（）用新鲜配制。
血溏测定试纸或试剂盒。
1.2.2仪器
血糖仪、全自动生化仪、721-B型分光光度计。
1.3剂量分组及受试样品给予时间
设1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组，根据人体每日 每公斤体重推荐摄入量，小鼠扩
大10倍作为其中一个剂量组（大鼠扩大5倍），根据受试样品的具体情 况另设两个剂量组。
受试样品给予时间原则上不少于30天，也可根据实验需要自行设定期限。
1.4实验方法
1.4.1降低空腹血糖实验
1.4.1.1高血糖模型动物
1.4.1.1.1原理
四氧嘧啶（或链脲霉素）是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤多种动 物的胰岛β细胞，造
成胰岛素分泌低下引起实验性糖尿病。
1.4.1.1.2造型
动物禁食24小时后，给予四氧嘧啶造型，5-7天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值
10-25m molL为高血糖模型成功动物。
1.4.1.1.3操作步骤
选高血糖模型动物按禁食3 -5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组
（组间差不大于1.1mmolL）。剂 量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续
30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较 各组动物血糖值及血糖降低的绝对值（即实
验前后血糖的差值）。
1.4.1.2正常动物
选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个受试样品组（高
剂 量）。余操作同1.4.1.1.3。
1.4.2糖耐量实验
高血糖模型动物禁食3-5小 时，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶
剂，15-20分钟后经口给予葡萄糖2. 0gkg或医用淀粉3-52.0gkg，测定给葡萄糖后0、0、
5、2小时的血糖值或人医用淀粉后 0、1、2小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组
给葡萄糖或医用淀粉后各时间点血糖曲线下面积 的变化。
血糖曲线下面积=12×（0小时血糖值+0.5小时血糖值）×0.5+12×（2小时血 糖值+0.5
小时血糖值）×1.5=0.25×（0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时 血糖值）.
1.5数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F
值 降 空腹血糖实验：受试样品剂量组与对照组比较，空腹血糖实测值降低有统计学意义，
可判定该受试样品降 空腹血糖实验结果阳性。
糖耐量实验：受试样品剂量组与对照组比较，在给葡萄糖或医用淀粉后、0. 0、0.5、2.0小
时血糖曲线下面积降低有统计学意义，可判定该受试样品糖耐量实验结果阳性。
1.6注意事项
1.6.1为了使实验动物糖代谢功能状态尽量保持一致，也为了准确地按体 重计算受试样品的
用量，实验前动物应严格禁食（不禁水），实验前后禁食条件应一致，鼠类在禁食的同 时
应更换衬垫物。
1.6.2血糖测定用试纸或试剂盒，按说明书操作；若自行配制试剂，按[附1]操作。
1 .6.3如用血清样品进行测定，应于取血后30分钟内分离血清，分离后血清的含糖量在6
小时内不变 。用血清制备的无蛋白血滤液可保存48小时以上。
1.6.4高浓度的还原性物质如Vit C亦能 与色素原竞争游离氧，干扰反应，使结果偏低。血
红蛋白能使过氧化氢过早分解，亦干扰反应，致使测得 血糖值偏低。故对已溶血的全血或
血清必须制备无蛋白滤液后，再进行测定。
[附1]血糖值测定方法
1原理
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化葡萄糖生 成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化
物酶作用下放出氧，使4-氨基安替比林与酚氧化缩合，生成红色 醌类化合物，可在波长
505nm比色测定。
2试剂配制
磷酸盐缓冲液（0.2molL, PH7.0）
0.2molL Na2HPO4 61ml，0.2molL KH2HPO4 39ml混合即可。
酶试剂
葡萄糖氧化酶4 00u，过氧化物酶0.6mg,4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg加磷酸盐缓
冲液至10 0ml，PH调至7。冰箱存放至少可稳定2个月。
酚试剂
酚100mg溶于100ml蒸馏水中。
酶混合试剂
取等量酶试剂和酚试剂混合。在冰箱中可存放1个月。
葡萄糖标准液
储存液：无水D-葡萄糖（A.R.）在烤箱中80℃烤4小时，冷却后，存放于干燥器中至恒
重。精确称取2g以0.25%苯甲酸溶液溶解并移入100ml容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀释
至10 0ml。
应用液：在100ml容量瓶中准确加入储存液5ml，再用0.25%苯甲酸溶液稀释至1 00ml，
即1mgmL应用液。
蛋白沉淀剂
溶解磷酸氢二钠10g、钨酸钠10 g、氯化钠9g于800ml蒸馏水中，加入1molL盐酸125ml，
并用蒸馏水稀释至1000m l。
3操作步骤
取蛋白沉淀剂1ml加入血浆（血清）50ul混匀。室温放置7分钟后， 离心，取上清液（无
蛋白血滤液）测定。葡萄糖标准应用液亦进行同样处理。

无蛋白血滤液mL
测定管
0.5
标准管
-
0.5

4
空白管
-
-
0.5
4
处理后的葡萄糖标准液mL -
蛋白沉淀液mL
酶混合试剂mL


4
混匀后，37℃水浴保温15分钟，用空白管调零点，在波长505nm处比色。
4结果计算
2人体试食试验
2.1试验设计
试验采用随机分组，组间和自身两种对照设计。
2.2受试产品
受试产品必须是具有定型包装、标明服用方法服用量的定型产品；安慰剂除功 效成分外，
在剂型、口感、外观和包装上与受试产品保持一致。
2.3受试者选择
2.3.1纳入标准
选择经饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药物品种及 剂量，仅服用维
持量的成年II型糖尿病病人，空腹血糖≥7.8mmolL（140mgdl）或餐后 2h血糖≥
11.1mmolL（200mgdl）；也可选择7.8mmolL≥空腹血糖≥6.7m molL（120mgdl）或
11.1mmolL≥餐后2h血糖≥7.8mmolL的高血糖人群。
2.3.2排除标准
2.3.2.1 I型糖尿病病人。
2.3.2.2年龄在18岁以下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，对受试样品过敏者。
2 .3.2.3有心、肝、肾等主要脏器并发症，或全并有其它严重疾病，精神病患者，服用糖皮
质激素或 其它影响血糖药物者。
2.3.2.4不合作者（指不能配合饮食控制而影响观察结果者）。
2.3.2.5近3个月内有糖尿病酮症、酸中毒以及感染者。
2.3.2.6凡不符合纳入标准，未按规定服用受试样品，或资料不全影响观察结果者。
2.4受试者分组
按受试者的血糖水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要 因素如病程、
服药种类（黄脲类、双胍类）等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受度者不< br>少于50例。、
2.5试验方法
试验前对每一位受试者按性别、年龄、不同劳动强度 、理想体重参照原来生活习惯规定相
应的饮食，试食期间坚持饮食控制，治疗糖尿病的药物种类和剂量不 变。试食组在服药的
基础上，按推荐服用方法服用量每晶是食受试样品，对照组在服药的基础上，可不进 行任
何处理（或服用安慰剂）。连续观察时间不少于30天，必要时可以适当延长。
2.6观察指标
各项指标于实验开始及结束各检测一次，必要时实验中期血糖指标可加测一次。
2.6.1安全性指标
2.6.1.1一般状况体征 包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等
2.6.1.2血、尿、便常规检查
2.6.1.3肝、肾功能检查
2.6.1.4胸透、心电图、腹部B超检查（仅试验前检查一次）
2.6.2功效指标
2.6.2.1症状观察
详细询问病史，了解患者饮食情况，用药情况，活动量，观察口渴多 饮、多食易饥、倦怠
乏力、多尿等主要临床症状，按症状轻重积分，于试食前后统计积分值，并就其主要 症状
改善（改善1分为有效），观察临床症状改善率。

临床症状积分表
无症
（积0分）
口渴多饮 无
轻症
（积1分）
中症
（积2分）
重症
（积3分）
有口渴感，饮水量口渴感明显，饮水量口渴显著，饮水
<1000ml日 1000-2000ml日 量>2000ml日
多食易饥 无
倦怠乏力 无
餐前有轻度饥饿感 餐前有明显饥饿感 昼夜均有饥饿感
精神不振，可坚持精神疲乏，勉强坚持精神极度疲乏，不
体力劳动 日常工作
尿量
2500-3000ml日
能坚持日常活动
尿量
>3000ml日
多尿 症状消失，尿量尿量
<1800ml日 1800-2500ml日

2.6.2.2空腹血糖
观察试食前后空腹血糖值及血糖下降的百分率。
2.6.2.3餐后2h血糖
观察试食前后食用100g精粉馒头后2小时血糖值及血糖下降的百分率。
2.6.3.4尿糖
用空腹晨尿定性，按—、±、+、++、+++、++++分别积0、0 、5、1、2、3、4分，于试
食前后统计积分值。
2.6.2.5血脂
观察试食前后血清总胆固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇水平。
2.7数据处理和结果判定
凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检 验，后者需进行方差齐
性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐 后，用
转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态或方差齐的要求，改用t’检验或秩
和检验；方差剂但变异系数太大（如CV>50%）的资料应用秩和检验。

结果判定 空腹血糖结果判定：①空腹血糖试验前后自身比较，差异有显著性，且试验后平均血糖下
降≥10% ，②试验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差异有显著性。满足
上述两个条件，可判定该 受试样品空腹血糖指标结果阳性。
餐后2h血糖结果判定：①餐后2h血糖试验前后自身比较，差异有 显著性，且试验后平均
血糖下降≥10%，②试验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差异 有显著性。
满足上述两个条件，可判定该受试样品餐后2h血糖指标结果阳性。