流式细胞仪检测正常人类精子细胞的凋亡-第三军医大学学报

2020年10月13日发(作者：汤显祖)

正常男性精子凋亡的流式细胞仪检测
王 芳
1
，罗 婧，王丽婷，孙 玮，张正治，潘 峰
（第三军医大学基础部中心实验室,重庆 400038）
摘要：目的 检测重庆市近郊男性精子细胞凋亡率，以了解在目前生活环境下男性的生
育力是否有改变。方法 用Annexin –V凋亡试剂盒对30例精子细胞样本进行染色后，用流式
细胞仪检测其凋亡率。结果 重庆近郊30例男性的精子细胞的凋亡率与国内外文献报道无明
显差别。结论 流式细胞仪检测精子细胞凋亡，Annexin-V是一种有效、准确、快速的方法。
关键词：流式细胞仪；精子细胞；细胞凋亡
中图法分类号： 文献标识码：
随着工业化进程加快，人们生活更加方便快捷，生活水平也不断提高，不过
人们 在享受现代科技成果的同时，也在经受环境污染对健康的危害。特别是大量
使用除草剂、杀虫剂、去污剂 、洗涤剂等，这些物质被统称为内分泌干扰物
（endocrine disrupting, EDs）。它们对男性生殖功能的影响，已引起社会各界的广
泛关注
[1]
。
细胞凋亡存在于细胞的增殖、分化中，是一种正常的现象。检测精子细胞凋
亡，是从分子水平评价精子 功能的重要指标，精子细胞凋亡率与男性生育能力密
切相关
[2]
。本实验用流式细胞 术检测重庆市近郊男性精子细胞的凋亡，以了解目前
生态环境下男性生育能力的变化。
1．材料与方法
1．1精液样本
受试者来自于重庆市近郊，以社区为单位进行收 集，以25~45岁的青壮年男
性为目标人群进行收集，共30例。禁欲3~5 d，手淫法采集精液，37°Ｃ水浴箱保
存，3h内送达实验室。
1．2方法和染色
用Annexin-V FITCPI试剂盒（碧云天公司），小心吸取上层云雾状细胞50μl，
加入145μl 结合缓冲液，加入5μl FITC ，避光室温孵育10min，1500rmin离心
10min， 沉淀用200μl结合缓冲液重悬，加入10μl PI ，1h 内上机检测。
1.3流式细胞仪检测条件及参数
采用美国Becton Dickinson 公司的FACS Calibur 型流式细胞仪，激发光源，
5mW氩离子激光器，激光波长为488nm 。应用CellQuest 软件收集及分析，用

作者简介：王芳，女，重庆市北碚区人，助理实验员。电话：（023）68752353，
E -mail :wangfangcxdoris@
通信作者：潘 峰 ,电话：（023）68752349

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FL1通道收集FITC 的信号，FL2收集PI 信号。将光电二极管的电压设为E01，
前向散射（FSC）参数设阈值为6 0，将进样速度控制在400~500个s。精子细胞的
FSC为横坐标、侧向散射（SSC）为纵坐标 ，以正常男性精子细胞为正常对照，获
取精子细胞的散点图。调节FSC、SSC ，把目标细胞群调在 收集框中央位置，设
门选取目标细胞群（图1）；然后调节FL1，FL2补偿值，获取荧光信号的双参 数
点图，FITC
-
PI
-
为双阴性细胞，FITC
+PI
-
为凋亡细胞（图1），并将对照凋亡率调至
4.9% 以下，每个样品收集2万个细胞，逐一收集样品（图1）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.1统计软件进行？检验？
2．结果
流式细胞检测结果见图1，统计结果见表1。

散点图 对照 样本
图1 精子细胞流式图
表1 精子细胞统计结果（改文字说明）

凋亡率
N
30
Minimum
1.86
Maximum
14.85
Mean
5.8773
ion
2.7982
表2 国内外文献与本次实验所测凋亡率（改文字说明）

凋亡率
受测男性精子细胞
5.87±2.80%
国内文献正常生育男性
[5]

4.28±1.66%
国外文献正常男性
[6]

4.90±3.30%
经单侧t 检验两两比较均显示p＞0.05 ，结果示差异不显著。
3．讨论
3．1 荧光染色方法对检测的影响.
按Annexin- VFITCPI试剂盒说明书操作步骤，在精子细胞悬液中，加入5μl
Annexin- VFITC和10μl PI混匀，于室温避光孵育15min后，加400μl PBS，作流
式细胞 分析。FITC的信号太弱，对照及实验样品的凋亡率<1%，与实验结果不符。

2

其原因是加入PI后，使液体局部碱性浓度过高而造成Ca
2+
析出，导致 FSC及SSC
散点图的改变和细胞凋亡率的下降
[3]
。改用1.3染色方法，检测 结果见图1。统计
结果（n=30）见表1。
3．2 Annexin- V在检测细胞凋亡的作用。
Annexin-V是一种Ca
2+
依赖性磷脂蛋白，含 319个氨基酸，相对于分子质量
35.8×10
3
。凋亡早期，Ca
2+< br>浓度升高，磷脂酰丝氨酸(phosphotidy lserine, Ps)由质
膜内层转移至外层，Annexin-V与Ps有高特异性结合。因此，用标记了的Anne xin-V
作为荧光探针，与凋亡细胞外侧暴露的Ps特异性结合，用流式细胞仪检测其凋亡，
Annexin-V是一种灵敏、准确、快速的方法
[4]
。
3．3 结果分析
本实验测出重庆市近郊社区30例精子细胞凋亡率为（5.87±2.80）%，与王光
荣等< br>[5]
及Ricci等
[6]
检测结果无明显差异。说明在目前的生态环境下， 重庆近郊男
性生育能力未受到明显影响。
已有专家发出警告：全球性人类精子质量再在不断下 降，男性不育症患者正
在不断增多，其原因与全球环境污染有很大的关系。研究发现，在精子的发生过< br>程中，始终都存在着细胞凋亡，在精子发生过程中起到重要的调节作用，从而维
持睾丸发挥正常的 功能。临床发现，生精功能低下和生精阻滞的患者睾丸生精细
胞凋亡明显高于正常生精功能的不育患者。 所以本实验用Annexin-V FITCPI荧光
染色，流式细胞检测精子凋亡率的方法，为检测精 子凋亡提供了较为理想的手段，
在评估精子功能和男性生育力的研究方向有广阔的应用前景。

参考文献
[1] 张信连. 环境内分泌干扰物对生物和人体健康的影响[J].国外医 学临床生物医学与检验
学分册，2005，26（6）：349-351.
[2] Jurjen E. Oosterhuis M D, Andre B, et al . Measuring apoptosis in human spermatozoa :a
biological assay for seman quality [J]. Fertility and Sterility, 2000,74(2):245-250.
[3] 尹琰，寿伟璋. 流式细胞术 Annexin-V细胞凋亡检测方法探讨[J].东南大 学学报（医学
版），2003，22（3）：169-170.Z
[4] Vernes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, et al. A novel assay for apoptosis-flow cytometric
detection of phosphatidylserine expression on early appoptic cell using fluorescein labeled
Annexin-V [J] .J Immunol Methods ,1995,184(1):39-51.
[5] 王光荣，周曾娣，葛争鸣，等. 精子凋亡与男性不育关系初探[J].中华男科学，2002，8（1）：
25-28.
[6] Ricci G, Perticarari S, Giolo E, et al. Apoptosis in human sperm : Its correlation with semen
quality and the presence of leukocytes [J].Hum Reprod, 2002, 17(10): 2665-2672.

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