基因工程笔记总结

2021年2月28日发(作者：丰胸的最快方法)
第二章

Enzymes
第四节

DNA
连接酶
Ligase
一、
DNA
连接酶的发现

二
.
连接条件

必须是两条双链
DNA
。

DNA3< br>’
端有游离的
-OH
，
5
’
端有一个磷酸基团
（
P
）
。
需要能量。

三、连接反应的机理
< br>1
、
A
TP
（
NAD+)
提供激活的
AMP
。

2
、
A
TP
与连接酶形成共价“连接酶
-AMP
”复合物，
并释放出焦磷酸
PPi
。

3
、
AMP
与连接酶的赖氨酸
?
-
氨基相连。

4
、
AMP
随后从连接酶的赖氨酸
?
-
氨基转移到
D NA
一条链的
5’
端
P
上，形成“
DNA-
腺苷酸 ”复合物。

5
、

3
’
-OH
对磷原子 作亲核攻击，形成磷酸二脂键，
释放出
AMP
。

Ligase：只连“
Nick
切口”
，不连“
Gap
缺口”

四
.
两种

DNA
连接酶

1. E. Coli DNA ligase
来源：












适用：粘性末端（
PEG
与高浓度一价阳离子存在可连
平末端）

2. T4 ligase
来源：
T4 phage




适用：粘性末端

及

平末端

T4 vs.
T4 DNA ligase
制备容易，
价格便宜，
能进行各种类型
连接反应，应用更广泛！

五
.Ligase
的反应温度

最佳温度：

界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是
4-15
℃比较合适。

六
.

DNA
分子连接的四种形式

1.
粘性末端；
2.
平末端；
3.
平末端加尾；
4.
平末端
加衔接物
(linker)
或接头
(adaptor)
(1)Digestion and Ligation
1
．粘性末端连接

Problem: (
自我环化作用
)
解决方法：
a
、双酶切（两种内切酶）
b
、去磷酸

2.
平末端连接

粘性末端连接效率高于平末端约
100
倍！

解决方法：化平末端为粘性末端
?

3.
平末端连接
---
同聚物加尾法

（
1
）末端脱氧核苷酸转移酶

功能：
5
’至

3
’单链聚合

作用特点：单链；无模版

作用机理：

a:
用
5
’
-
特异的核酸外切酶处理
DNA
分子，以便移
去少数几 个末端核苷酸
,
获得
3
’
-OH
的单链延伸末
端。

b:
加入
dA
TP/dTTP
和末端脱氧核苷酸转移酶组成的
反应混合物 中，
DNA
分子的
3-OH
末端将会出现单纯
由
poly( dA)
和
poly(dT)
组成的
DNA
单链延伸。

c:
获得
poly(dA)
和
poly(dT)
尾巴，< br>就会彼此连接起来。

缺点：

当
poly(dA)
，
Poly(dT)
不严格等长时
,
重组
DNA
分子会有缺口。

需要用
DNA
聚合酶
I
填补，
然后 用
DNA
连接酶连接
最后的缺口。

4.
平末端连接

---
衔接物连接法与接头连接法


(1)
平末端的衔接物连接法

衔接物的
5
’
末 端和待克隆的
DNA
片段的
5
’

-
末端，
用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过
T4 DNA
连接< br>酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔
接物的
DNA
分子和克隆载 体分子。

(2)
平末端的接头连接法

将具有某种限制性酶(BamHI)
粘性末端的典型
DNA
接头分子与平末端的
DNA
片段连接后，后者变成具
有粘性末端的
DNA
分子。

七
.
热稳定的
DNA
连接酶——来自嗜热高温放线菌

热稳定的
DNA
连接酶的应用：

寡核苷酸连接测定法（
oligonucleotide
ligation
assay,
OLA
）

连接酶链式反应（
ligation chain reaction, LCR
）


寡核苷酸连接测定法的作用

检测突变

寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。

1.
寡核苷酸连接测定法

（
1
）原理
:
两条寡聚核 苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶
DNA
之间的杂交作用
,
这两条寡聚 核苷酸探针分子在
靶
DNA
分子上的位置是彼此相邻的。

当他们同靶
DNA
链是完全碱基配对时，便可以被连
接酶连接起来。

结合点或靠近结合点处存在和靶
DNA
错配的碱基两
个探针之间不能形成磷酸 二脂键。


第五节

DNA
聚合酶
DNA Polymerase
常用的
DNA
聚合酶：

1
、大肠杆菌
DNA
聚合酶Ｉ

2
、大肠杆菌DNA
聚合酶Ｉ的
Klenow
大片段酶

3
、
T4 DNA
聚合酶

4
、
T7 DNA
聚合酶

5
、反转录酶等。


一、大肠杆菌
DNA
聚合酶Ⅰ

DNA
聚合酶Ⅰ特点

活性：

5
’





3
’聚合





低









5
’





3
’外切





有









3
’





5
’外切





低

DNA
聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记

(1)DNA
聚合酶Ⅰ的两种特殊反应：

切口转移与链取代

(2)
切口转移法制备放射性
DNA
分子杂交探针


二、
Klenow
片段

1
、
DNA
聚合酶Ⅰ的
Klenow
片段

活性：









5
’




3
’聚合




低









5
’




3
’外切




无！









3
’




5
’外切




低

2.
Klenow
片段的应用

末端补平

末端标记及随机引物标记

cDNA
第二链合成（见
cDNA
文库构建）

DNA
测序


三
.
T4 DNA
聚合酶

1. T4 DNA
聚合酶特点

活性：









5
’





3
’聚合











低









5
’





3
’外切











无









3
’





5
’外切











高！

2.T4 DNA
聚合酶活性的条件

模版、引物、原料
dNTP
3. T4 DNA
聚合酶的“取代合成”法末端标记

四
.
T7 DNA
聚合酶

1. T7 DNA
聚合酶特点

活性：









5
’


3
’聚合





高！









5
’


3
’外切





无









3
’


5
’外切





高


2. T7 DNA
聚合酶的应用

合成：高活性，几
kb
，不受
DNA
二级结构的影响
标记：类似
T4
（取代合成）

末端补平：类似
T4

第六节核酸修饰酶

一
.
修饰的

T7 DNA
聚合酶

活性：









5
’


3
’聚合





更高
(*3)
！









5
’


3
’外切





无









3
’


5
’外切





无！

修饰的
T7 DNA
聚合酶的应用：

合成能力：更高、更快、更强！

标记：重在“掺”与

末端补平：

二
.
激酶
(kinase) &
磷酸酶
(phosphotase)
T4
多核苷酸激酶

(1)
特点

来源：
T4
噬菌体
pseT
基因编码；

活性：
5
’
-OH
加磷酸；

(2)T4 kinase 5
’末端标记的机理

用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使
5< br>‘
OH
基国暴露，
同多核苷酸激酶从
r-P ATP
分子中转移来的
r-P
基团键
合，实现末端标记。

(3) T4
多核苷酸激酶的应用

a: 5
’末端标记

b: 5
’末端磷酸化


磷酸酶

(1)
特点

来源：
细菌碱性磷酸酶
（
Bacterial Alkaline Phos photase
，
BAP)
，

；小牛肠碱性磷酸酶（
Cal f
intestinal
Alkaline Phosphotase, CIAP)
，小牛肠。

活性：

5
’
-P
去磷酸

(2)
磷酸酶作用机理

催化核酸分子脱掉5
‘－
P
，使
DNA
分子
5
’－
P< br>转
化成
5
‘－
OH
－－－脱磷酸作用。

这 样产生的
5
‘－
OH
末端，为随后在
[r-P]A
TP和
T4
多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。

(3)
磷酸酶的应用

末端标记前处理

防止
DNA
分子自身环化

(4) BAP
与
CIAP
比较

热稳定性（
65
℃）

BAP
：
active CIAP
：
30min
失活


第七节

核酸外切酶


1.
核酸外（
Exonucleases
）切酶

定义
:
一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核
苷酸的酶。


分类：单链的核酸外切酶




双链的核酸外切酶


第八节

核酸内切酶

1. S1
核酸酶

(1)
特点：


活性：降解单链核酸（
DNA
或
RNA
）为单核苷酸；
降解双链核酸 的单链区

(2) S1
核酸酶的应用
----RNA
分子的定位

2.
Bal31
核酸酶

Bal31
核酸酶的三种活性：

（
1
）单链核酸内切

（
2
）双链核酸外切

（
3
）双链切口对应链

Bal31
核酸酶主要用途：

（
1
）诱发
DNA
发生缺失突变

（
2
）定位测定
DNA
片断中限制性位点的分布

（
3
）研究超盘旋
DNA
分子的二级结构

3.
其他核酸酶

外切核酸酶Ⅲ（
Exonuclease
Ⅲ）
：
3
’至
5
’外切

RNA
酶Ⅰ
(RNase
Ⅰ
)
：切割
DNA- RNA
杂合链中的
RNA
其他核酸酶
:
外切核酸酶Ⅲ（
Exonuclease
Ⅲ）
：
3
’至
5
’外切

DNA
酶Ⅰ（
DNase
Ⅰ）
：随机切割
ss & dsDNA
RNA
酶Ⅰ
(RNase
Ⅰ
)
：切割
DNA-RNA
杂合链中的
RNA


第三章

Techniques
基因工程技术

Outline
1
、电泳

2
、分子杂交

3
、转化与转染

4
、核酸测序

5
、
DNA
扩增
---PCR
6
、核酸
-
蛋白相互作用


第一节

电泳

原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中
运动。

目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同
的分子（依据不同的凝胶体系）
。

电泳的分类：

琼脂糖凝胶电泳（
agarose gel electrophoresis
）
，

聚
丙
烯
酰
胺
凝
胶
电
泳
（
polyacrylamide
gel
electrophoresis
，
PAGE
）


琼脂糖凝胶电泳（
agarose gel electrophoresis
）

ds-DNA
目

的：

分离不同长度的
DNA
片段

a.
确定
DNA
片段的长度

b.
确定
DNA
的有无与多少

c.
分析酶切产物

凝胶电泳的原理
:
略

电泳步骤

第一步：制胶

第二步：样品制备

第三步：点样

第四步：跑电泳

第五步：紫外灯下检测，拍照

第六步：数据处理




缓冲体系：

TAE, pH 8.0, ~50 mM - Tris, Acetate, EDTA
TBE, pH 8.0, ~50 mM - Tris, Borate, EDTA
影响迁移率的因素：

凝胶的孔径

电压

DNA
片段长度及结构

EB
的影响


分辨率影响因素：

琼脂糖浓度

缓冲液或样品的盐离子浓度

核酸上样量

电压


聚
丙
烯
酰
胺
凝
胶
电
泳
（
poly-acrylamide
gel
electrophoresis
，
PAGE
）

范围：短片段






分辨率：
1bp
类型：

变性胶（长度）
、

非变性胶（长度、构型）

变性胶：
1
、
含尿素；
2
、
DNA
样品经甲酰胺与热处理；
3
、电泳保持温度。


Agarose
与

PAGE
的不同：

分辨率

操作

应
用
：
RFLP,
AFLP,
DD-PCR,
sequencing,
primer
extension, S1 mapping, RNase protection ass
ay…



第二节

分子杂交

一
.
分子杂交概述

(1)
定义

分 子杂交（
molecularhybridization
）
：不同来源的核酸
单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非
共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术 统
称为分子杂交技术。


(2)
用途

形成< br>DNA
／
DNA(DNA
／
RNA)
杂种分子，可以用来
a.
检测特定生物体之间的亲缘关系。

b.
揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

c.
对目的基因进行相对定量。

d.
对特定蛋白质进行定性及定量分析

(3)
杂交的基本步骤

以核酸分子杂交为例：

凝胶电泳分离的
DNA/RNA
吸印
,
转膜

(
通过毛细管作用或电导作用
)
探针标记

杂交

检测

(4).
种类

Southern: DNA- DNA
Northern: DNA-RNA
Western: Pr-Pr

二
. Southern blotting

1.
Southern Blotting
(1)
目的：检测特定
DNA
序列。

(2)
原理 ：电泳分离
DNA
，并将之转至尼龙膜上，以
标记好的探针（
DNA
）与之杂交。

(3)
步骤

Protocols
a.
基因组
DNA
制备


酶切消化

c.
琼脂糖凝胶电泳分离
DNA
片断

d.
碱变性，中和


e.
转移
DNA
到固相支持物
(
如，尼龙膜
)
f.
杂交反应

g.
放射自显影

h.
数据分析

2. Other DNA analyses
（
1
）
斑点杂交

(dot blotting)
与狭线杂交

(slot blotting)
（
2
）菌落与噬菌斑杂交

(1) Dot blotting, slot blottlng:
将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂
交检测。 多用于病原体基因检测，如微生物的基因

。
(2)
菌落与噬菌斑杂交（过程略）


三
.

Northern blotting

1.
Northern Blotting
(1)
目的：检测特定序列的
RNA
的长度与丰度。

(2 )
原理：
电泳分离
RNA
，
并将之转至尼龙膜上
（
blot)
，
以标记好的探针（
DNA
）与之杂交。

实验过程基本上同
Southern

Southern blot
和
Northern blot
区别：

1
）
RNA
分子较小，不需进行限制性内切酶切割；

< br>2
）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使
RNA
变
性，而不用NaOH
，因为它会水解
RNA
的
2
’
-
羟基
基团；


3
）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则
RN A
会被
洗脱；


4
）在胶中不能加
EB
，因它为影响
RNA
与硝酸纤维
素膜的结合；

5
）操作均应避免
RNase
的污染。

(2) Ribonuclease protection assay
过程：

RNA
和探针在液体混合物中杂交
.
未杂交上的
RNA
和探针被核酸酶降 解，这种核酸酶
只识别单链
RNA
。

杂交后的探针和
RNA
复合体通过琼脂糖凝胶电泳分
离。

转膜，放射自显影。


RPA
有
Northern Blot
无法比拟的优势：

过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应
更加完全

。

RPA
比
Northern Blot
灵敏
15
－
150
倍，
适合检测各种
表达水平之基因

。

RPA
通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一
情况下的差异表达。


一次
RPA
就能完成
10
多次
Northern Blot
的工作，
加
快研究速度。


主要缺点：

RNA
探针的制备麻烦。

核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，
X
片上什么都没有。

(3) Reverse Northern blotting

四
. Western blotting

1. Western Blotting
(1)
目的：检测特异性蛋白质有无及表达量。

(2)
理论依据：抗原
-
抗体特异性相互作用。

(3)< br>原理：电泳分离蛋白质，并将之转至膜上（
blot)
，
以标记好的抗体（antibody
）与之杂交。

“探针”是抗体，
“显色”用标记的二抗

(4)
免疫应答
:
略

Western Blot
显色的主要方法：

a.
底物化学发光
ECL
b.
放射自显影

c.
底物荧光

ECF
d.
底物
DAB
（二氨基联苯胺）呈色

底物化学发光
ECL
二抗用
HRP
标记，反应底物为过氧化物+
鲁米诺，底
物遇到
HRP
发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

Western analysis

2.
分子杂交技术与细胞学的结合

(1)
原位杂交（
in
situ
hybridization
）与荧光原位杂交
（
Fluorescent in situ hybridization, FISH
）

原理：标记的探针与 在细胞原位的
DNA
分子杂交，
通过显色反应其相应
DNA
在细胞染 色体中的具体位
置。

(2)
免疫组织化学（
immunohist ochemistry
）



第三节

外源核酸导入细胞的方法

一
.
概述

二
.
大肠杆菌的转化


三
.
植物的转化


一
.
概述

1.
转化
/
转染

（
1
）转化
(Transformation)
是将外源
DNA
分子引入受
体细胞
,
使之获得新的遗传性状的一种手段
,
它是微生
物遗传、分子遗传、基因工 程等研究领域的基本实验
技术。


(2)
基因转移的目的

扩增重组
DNA
功能表达

(3)
转化与转染

转染
（
Transfection)
：
当细菌的转化过程中吸收的外 源
DNA
是病毒
DNA
时就应该称此过程为转染。

对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词，
而转化指正常细胞转变为癌下表过程。


2.
外源基因导入的方法

(1)
热休克法（
heat-shock)
影响热休克法转化效率的因素

DNA
：构型、纯度、浓度

受体菌：
R/M
体系缺陷型；生理状态及成活率

环境：温度、
pH
、离子浓度

(2)
电穿孔法

(Electroporation)
转化的原理与技术：

高压电脉冲作用使细胞膜上出现小孔。

电穿孔法影响因素：

电压

脉冲持续时间

细胞类型

(3)
微弹轰击法
(gene-gun)
用压缩气体（氦／氮）动力，产生 一种冷的气体冲击
波进入轰击室，将包裹在金属颗粒表面的外源
DNA
随金属颗粒穿过 细胞壁，细胞膜，细胞质等，层层到
达细胞核。

(4)
显微注射
(Microinjection)
用微吸管吸取供体ＤＮＡ溶液，在显微镜下准确地插
入受体细胞核中的直接转移方法。


(5)
脂质体（
Lipofectin
）

由人 工合成磷脂类双分子层的脂质体包埋
DNA
，
然后
进行脂质体与细胞膜的融合 （内吞）
，将外源
DNA
导
入细胞。

(6)
反转录病毒

具有感染性的病毒颗粒，可以介导目的基因转染到分
裂细胞。


二
.
大肠杆菌的转化

1.
成功转化的必要条件

(1)
感受态（
competence
）
：





a:
细菌能够获取外源
DNA
的状态。





b:
特定蛋白与
DNA
结合形成可以抵御核酸酶的
复合物。

(2)
复制子（
replicon
）外源
DNA
稳定存在。

(3)
外源
DNA
的功能表达。

2.
感受态大肠杆菌的制备


3.
大肠杆菌的转化
------
以
pGLO
质粒为例


三
.
植物的转化

1.
应用

2.
转化的方法

3.
农杆菌介导的转化


1.
应用

a.
提高植物的农业价值和园艺价值

b.
生物反应器（蛋白
/
次生代谢产物）

c.
研究基因在发育、代谢途径中的作用

2.
转化的方法

植物遗传转化技术可分为两大类：

一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质 体
法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、
PEG
介
导转化方法等，其中 基因枪转化法是代表。

另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和
病毒介导 两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法
操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植
物的遗传转化。


3.
农杆菌介导的转化

(
一
)
农杆菌的
Ti
质粒与
T-DNA
的整合机制

酚类
--
（启动）
--Ti
质料上的
Vir
基因< br>--
（表达）
--Vir
基因产物
--
（切断）
--
质料上的
T-DNA
单链；切下来
的单链
T-DNA
与操纵 子基因产物形成复合物，转化
植物根部细胞。

T-DNA
上有三套基因，
其中两套基因分别控制合成植