基因工程与分子生物学

2021年2月28日发(作者：关节炎怎么治疗)
基因工程与分子生物学重点

1
．限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的< br>DNA
分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性
核酸内切酶，简称为限制性酶。

2
．限制性核酸内切酶的一般性质：
37
℃
，
pH
为
7.2~7.6
，用
Tris
—
HCl
，
Gly
—
NaOH
两种缓
冲液，
Mg2+Buffer
，
5mM
，盐浓度，巯基试剂：
β
-ME
，
DTT
，
BSA
（牛血清白蛋白，稳定
酶的作用）
；决定生产的特定的
DNA
片段的大小，识别顺序具有
180°
的旋转对称，识别顺
序一般是
4~6个碱基，也有
6
个以上的，但是没有
4
个以下的，产生三种不同的切口< br>:
形成
平头末端（
Smal
Ⅰ
）
：连接困难，效率较 低；形成
5’
粘性末端（
EcoR
Ⅰ
）
：相对而言，
5’
突出
尾，
3’
凹末端；形成
3’
粘性末端（
Pst
Ⅰ
）相对而言，
3’
突出尾，
5’
凹末端。

3
．星活性：在非标准条件下（低盐和高
pH
，高甘油浓度
>5%< br>）
，限制酶识别顺序与切割顺
序发生改变的现象。

4
．大肠 杆菌
DNA
聚合酶
I
大片段（
Klenow
片段）
：将
Pol1
切下一个小片段失去
5’
到
3’
外
切 酶活性。补平限制酶切割
DNA
产生
3’
凹槽（
5’
到3’
合成）
，用
[32p]dNTP
补平
3’
凹端，< br>对
DNA
片段进行末端标记，
对带
3’
突出端的
DN A
进行末端标记
（利用置换活性）
，
在
cDNA
克隆中，用 对和陈那个
cDNA
的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链
DNA
，
应用
Sanger
双脱氧末端终止法进行
DNA
测序，消化限制 酶产生的
3’
突出端，应用于
PCR
技术。

5
． 基因工程的工具酶：
T7
噬菌体
DNA
聚合酶，修饰的
T7
噬菌体
DNA
聚合酶，
TaqDNA
聚合酶（没有校正功能）
，大肠 杆菌
DNA
聚合酶Ⅰ
，大肠杆菌
DNA
聚合酶Ⅰ
大片段，< br>T4
噬
菌体
DNA
聚合酶。

6
．末端转移 酶：将相同的核苷酸依次连接到
3’
末端，然后两条
DNA
通过同源多聚尾巴 连
接在一起，在表达前将
ploy(G)
切除，否则影响蛋白质的生物活性。

7
．
T4
噬菌体多核苷酸激酶：使
DNA
的
5’< br>端磷酸化，也可以使
DNA
的
5’
端去磷酸化。可
以发生正向 反应，也可发生交换反应。正向反应：
5’CTGCAG
在酶和
ATP
（ATP
具有
α
，
β
，
γ
磷酸基团，其中
γ
可给出）的作用下，生成
5’pCTGCAG
；交换反应：
5’pCTG ACG
在酶和
ADP
的共同作用下，去磷酸化，将
DNA
链上的磷酸 基团给出，生成
5’CTGCAG
和
ATP
，
在
酶和
被标记的
A
TP
作
用下
使得
DNA
再
次 被
磷酸
化同时
被标
记，生
成
ADP
和
5’ *pCTGCAG
。

8
．基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯 质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链
DNA
噬菌体
M13
，真核病毒载体，酵母质 粒载体，杆状病毒。

9
．质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行 复制，并且在细胞分裂时能
恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。

10
．质 粒作为基因工程载体所必备的条件：
1
）具有较小的分子量和松弛的复制子，
2
）基因
组上有
1~2
个筛选标记，
便于在平板中区分重组体和非重组体，< br>3
）
DNA
链上有
1
到几个限
制酶的单一识别与切割 位点，便于外源
DNA
的插入，
4
）具有插入失活（或是插入表达）
的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。

11
．
Ti
质粒 ：引起植物形成肿瘤
—
冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。

12
．
Ti
质粒的优点：宿主范围广泛，
Ti
质粒能过转化所有的双子叶植物，并将 外源基因导
入植物细胞；
整合到宿主细胞
ch
—
DNA
上的
T
—
DNA
成了染色体的正常遗传成分，
永远居
留，
代代相传；
T
—
DNA
上的
Opine
合成酶基因有一个 强大的启动子，
能启动外源基因在植
物细胞中高效表达。

13
．分 子杂交（杂交，
hybrdization
）
：核酸研究中一项最基本的实验技术，它 是指在一定条
件下互补核酸链复性形成双链的过程。

14
．分子杂交的原理 ：
(
一
)DNA
的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象，确切的说是维持双螺旋结果稳定的氢键和疏水键的断裂，
DNA
变性不涉及到其
一级结构的改变；
（二）
DNA
的复性：指变性的两条互补
DNA< br>链在适当条件下，全部或部
分恢复到天然双螺旋结果的现象，它是变形的一种逆转过程。热变性< br>DNA
一般经缓慢冷却
后便可复性，此过程称之为
“
退火
”< br>（
annealing
）
。

15
．
Sou thernblot
操作技术：
将获取得
DNA
样品进行琼脂凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上的
DNA
片段按原有的顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用< br>32P
标记的
DNA
或
RNA
探针与之杂交，用发射自显影技 术确定任何能与探针
DNA
或
RNA
杂交的带。

16．
Northernblot
操作技术：
将获取得
RNA
样品进 行琼脂糖凝胶变性电泳，
将琼脂糖凝胶上
的
RNA
按原有顺序转移到一张硝酸 纤维素薄膜上并固定下来，
用
32P
标记的
DNA
或
RNA
探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针
DNA
或
RNA
杂交的带。

17
．
Westernblot
操作技术：将获取得蛋 白质样品进行聚丙烯凝胶电泳，将聚丙酰胺凝胶上
的蛋白质带按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并 固定下来，
用
32P
标记的
DNA
或酶
标记的蛋白质探针与 之杂交，
用发射自显影技术确定任何能与探针
DNA
或
RNA
杂交的 带。

18
．原位杂交：转为鉴别阳性重组体而设计的
DNA
杂交法 ，若受体
DNA
是从转化的菌落
释放，则原位杂交又称菌落杂交，若受体
DN A
从转染的空斑释放，则称空斑杂交。基本程
序：在硝酸纤维素薄膜上接种转化细胞长出菌落（ 或空斑）并溶解释放
DNA
通过变性和干
燥，使
DNA
在原有位置固 定，作为杂交的受体
DNA
，以后的杂交和放射自显影与前两种
方法基本相同，
原位杂交是鉴别阳性重组体的精确和快速方法，
一张硝酸纤维薄膜上筛选的
菌落可达到上百个 。

19
．探针标记：放射性标记：大肠杆菌
DNA
聚合酶
IKlenow
片段标记合成的寡核苷酸，达
成杆菌
DNA
聚合酶
I
标记寡核苷酸探针，
T4DNA
聚合酶标记寡核苷酸探针，
末端转移酶标记寡核苷酸探针，
T4
噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针；体内标记：生物体的新陈代
谢，食物、营养来源标记探针，非放射性标记（成本高，污染小）
:
地高辛，化学发光 素。

20
．分子克隆：讲一个基因片段插入到另一个载体
DNA
中 ，组成重组
DNA
分子，将它转
入到受体细胞中复制扩增，
即进行无性生殖，
由于这类克隆在分子水平上操作，
故称为分子
克隆。

21
．外源基因导入宿主细胞的方法：
1
）逆转录病毒感染法：产物用于食品，医药一般不采
用该方法，但在科研上效果好；
2
）
DNA
显微注射法：在显微镜下，用显 微镜将目的基因注
射入宿主细胞内，但对宿主细胞的机械损伤较大；
3
）磷酸钙转染技 术：磷酸钙反复转染，
是的
DNA
沉淀下来，
易接受外源
DNA；
DEAE
葡聚糖转染技术：
DEAE
葡聚糖与目的基因
共沉淀 ，易于细胞结合；
5
）聚阳离子
—
DMSO
转染技术：
DM SO
较强的去污剂，对宿主细
胞有机械损伤，转入宿主细胞内时间过长，机械损伤过大；
6
）电穿孔技术：电击，产生微
小孔洞使得目的基因转入，强度时间的控制很重要，防止致死 细胞；
7
）
原生质体融合技术：
充足
DNA
分子包裹在人工 膜
（脂质体转染）
内，
然后直至体育宿主细胞融合导入目的基因；
8
）精子载体介导法：局限性，与卵子结合，受精卵受精成熟的后，鉴定再哪个组织细胞中；
9
） 胚胎干细胞法：胚胎干细胞培养困难，增长传代系数。

22
．遗传选择标记：
1
）胸腺核苷酸基因（
tk
）
：验证生物活性，用
HAT
培养基（
H
次黄嘌
呤，
A
氨基嘌呤，
T
胸腺嘧啶核 苷）
；
2
）二氢叶酸还原酶基因（
dhfr
）
：二氢叶酸在 二氢叶酸
还原酶作用下还原成四氢叶酸，
dhfr
—
不能还原成四氢叶酸，使 得细胞死亡；
3
）氯霉素乙
酰转移酶基因（
cat
）
：氯霉 素乙酰转移酶将氯霉素乙酰化，是氯霉素失效，
cat
—
则不能是氯
霉素乙酰 化，细胞死亡；
4
）细胞的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（
ecogpt
）
；
5
）细
菌的新霉素磷酸转移酶基因（
econeo
）
。

1
．
哺乳动物基因转移中常用的报告基因：
1
）
人生长激素基因
（
hGH
，
humangowthhormone
）
；
2
）
碱酶基因
（
alkalinephosp hatase
）
；
3
）
半乳糖甘酶基因
（
Lacz
）
；
4
）
荧光素酶基因
（
luciferas）
；
5
）绿荧光蛋白基因（
GFP
，
Greenflu orescentprotein
）
；
6
）邻苯二酚
—
2< br>，
3
—
双加氧标志基因
（
CatO2aseCatechol :Oxygen2,3
—
oxidoreductase
）

2．植物基因工程常用的基因：
（一）抗植物病虫病基因：
1
）
Bt
基因（苏云金杆菌杀虫结晶
蛋白基因）
；
2
）昆虫的蛋白酶抑制剂基因：丝 氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属
蛋白酶抑制剂；
3
）植物凝集素基因（< br>lectingene
）
；
4
）淀粉酶抑制剂基因；
（二）抗 植物病
毒基因：
1
）
cp
基因（外援的病毒外壳蛋白基因）
；
2
）病毒复制酶基因；
3
）病毒卫星
RNA
的利用：卫星
RNA
是多核苷酸，他们有时在其相伴的病毒中被发现，它们按照相伴病毒的
复制和传 播机制，
从一个植株传到另一个植株，
它们不与其相伴病毒序列同源，
对病毒的复制也不起作用，但卫星
RNA
具有改变其相伴病毒的致病力的能力；
4
） 核糖体失活蛋白基
因：产物是核糖体失活，影响病毒蛋白质合成；
5
）干扰素基因；< br>6
）缺陷干扰颗粒
（
defectiveinterfering
，< br>DI
）指那些序列与亲本病毒相关的，但必须依赖于病毒才能复制的
DNA
分子 ，这种分子多存在于动植物病毒中；
（三）抗植物真菌病毒基因：
1
）几丁质酶与β—
1
，
3
—
葡聚糖酶，几丁质酶降解几丁质（聚
N< br>—
乙酰胺基葡萄糖）
，几丁质是构成真菌细
胞壁的成分，
β—
1
，
3
—
葡聚糖酶降解
β—
1
，
3
—
葡聚糖，后者也是构成真菌细胞壁的成分；
2
）植物抗毒素基因；
3）
RIP
基因：核糖体蛋白失活基因，使真菌蛋白不能合成；
4
）过氧< br>化物基因：
木质素由苯基类丙烷醇缩合而成，
它可增强细胞壁的强度，
增加抗真 菌的穿透的
压力，
而且抗原菌酶的降解，
从而限制了真菌酶和毒素向宿主扩散以及水和 营养物质从寄主
向真菌扩散，过氧化物酶催化苯基类丙烷醇脱氢酶聚合成木质素；
（四）抗植物 细菌病毒基
因：病原菌本身的抗性基因（类似于抗生素）
；杀菌肽基因（杀菌性的特异性不强， 广谱杀
菌）
；溶菌酶基因（破坏细菌的细胞壁）
。

3
．高 等植物基因转化方法：根瘤农杆菌
—
Ti
质粒系统；化学刺激法；
电脉冲法； 基因枪法；
电击注入法；脂质体法；直接注射法；激光微束发；超声波法；花粉发。

4
．
植物基因工程常用遗传选择标记：
Npt
—
II
基因< br>（新霉素磷酸转移酶基因或氨基糖苷磷酸
转移酶基因，
Aph
—
II< br>）
，
DHFP
基因（二氢叶酸还原酶基因）
；
HPT
基因（潮霉素磷酸转移
酶基因）
；
Gent
基因（庆大霉素抗性基因）
；抗除锈迹的标记基因；争光霉素（博来霉素）
抗性基因；
Blas
（杀稻瘟菌素）
；磺胺类药物。

5
．
PCR
技术原理：
DNA< br>双螺旋结构的生物功能主要是在与复制和转染，以加热或碱变性
作用可以使
DNA
双螺旋的氢键断裂，双联竭力，形成单链
DNA
，这称为
DNA
变性，解除
变性条件后，变形的单链可以重新结合起来，形成双链，其原有的活性复原，称为
DNA
复
性，又称退火，变形和复性在一定条件下是完全可逆的。
PCR
扩增是一种特定区 段
DNA
的
复制，遵循
DNA
生物合成的基本规律，其复制方法是一 般保留形式进行的，但
PCR
中的
DNA
复制必须有
DNA
模版，
DNA
聚合酶，
DNA
引物和四种
dNTP
，要扩增 模板
DNA
中
的某一片段，需设计一对寡核苷酸引物，
它们分别与两条
DNA
模板链
3’
末端互补，
PCR
扩
增系统中模板DNA
经过高温变性后，分解为两条单链，通过低温退火，引物与模板
DNA
结合 ，形成局部双链，这是
DNA
复制的固定起点，由此
DNA
聚合酶可以进行链 的延伸，
合成与模板互补的链，
模板
DNA
经过高温变性，
低温退火 和中温延伸三个阶段的循环过程，
每循环一次，模板
DNA
的拷贝数就增加一倍。
6
．
PCR
反应体系：引物（自行设计）
，模板（
D NA
来源）
，
Taq
酶（
5’
到
3’
聚合 酶活性，但
没有
3’
到
5’
外切酶活性）
，
dNT Ps
（底物）
，缓冲液（
Buffer
，含有一定的离子浓度、
pH
值）
，
BSA
（牛血清白蛋白）
，
Mg2+
（Taq
酶的辅助性因子）
。

7
．引物的设计原则：
1
）引物的长度应在
15~30bp
（一般为
18~25
左右，太小或 太长均可能
致使非特异性配对）
；
2
）
引物中碱基的分布应当是随机 的，
避免一连串单个碱基或其他不常
见的结构；
3
）
GC
碱 基的含量在
45~55%
左右；
4
）两个引物在
3’
端均必 须与模板互补，
5’
可以不互补；
5
）
引物自身连续互补碱基小于< br>4
个
（若过长，
引物自身回旋，
形成二级结构）
；