基因工程知识点

2021年2月28日发(作者：除皱霜)
基因工程

1
、操作水平：
DNA
分子水平


目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。

理论基础：
1
）物质基础——脱氧核苷酸


2
）结构基础——规则的双螺旋结构


3
）中心法则，共用一套遗传密码

2
、基因工程
(genetic engineering)
：
指重 组
DNA
技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。


上游技术
指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组
DNA
技术）
；而
下游技术
则涉及到基因工程菌或细


胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
(
基因操作、遗传工程、重组
DN A
技术）
。


1973
年诞生的

基本 用途：
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性 状甚至
新物种。

3
、重组
DNA
技术
：是指将一 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）
内，使之按照人们 的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的
DNA
体外操作程序，也称为分子克隆技术。其核心 步
骤是
DNA
片段之间的体外连接。

4
、基因工程的基本形式：

第一代基因工程


蛋白多肽基因的高效表达


经典基因工程



第二代


蛋白编码基因的定向诱变


蛋白质工程

第三代基因工程


代谢信息途径的修饰重构


途径工程







第四代


基因组或染色体的转移




基因组工程

5
、基因工程诞生的理论基础：理论上的三大发现

1
】证实了DNA
是遗传物质；
2
】揭示了
DNA
分子的双螺旋结构模型和 半保留复制机理；

3
】遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。
6
、
DNA
双螺旋：带负电的糖
--
磷酸骨架在外侧，碱基在螺 旋中间相互堆叠，以
5
’→
3
’方向反向平行关系。


第二章

用于核酸操作的工具酶

1
、寄主的限制和修饰现象：

【１】作用：
保护自身ＤＮＡ不受限制；

破坏入侵的外源ＤＮＡ，使之降解。

【２】
入侵噬菌体的子代便能高频感染 同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿
主甲基化酶修饰的同时，也 丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。

2
、限制性核酸内切酶的命名：
如：
Hind
Ⅰ

属名（
H
）
+
种名（
in
）
+
株名（d
）
+
类型（Ⅰ）

II
型限制性核酸内切酶的基本特性：
识别双链
DNA
分子中
4 - 8
对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序
列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对 称型回文结构。

**
一个单位的限制酶定义为：
在合适的温度和缓冲液中，
在
50
μ
L
反应体系中，
1h
完全降解
1
μ
g
底物
DNA
所需的酶量。

两种
DN A
甲基化酶：
①
DNA
腺嘌呤甲基化酶（
dam
）
，甲基化酶在
5
’
GATC3
’序列中的腺嘌呤
N6
位引入 甲基
.
②
DNA
胞嘧啶甲基化酶（
dcm
）
，甲 基化酶在
5
’
CCAGG3
’或
5
’
CCTGG3
’序列中的胞嘧啶
C5
位上引入甲基，
受其影响的酶有
EcoR II
等
.
1

高甘油含量》
5%
；

○
2
内切酶用量过大；

○
3
低离子强度；
○
4
高
pH
；

**3
、诱发星号活性产生的原因：○
5

含有有机溶剂，如乙醇；
○
6
Mn/Cu/Zn
等非
Mg
二价阳离子存在。

○
4
、
DNA
聚合酶

I
的基本性质：< br>5
‘→
3
‘
DNA
聚合酶活性
；

5
‘→
3
‘的核酸外切酶活性
；
3
‘→
5
‘的核酸外切酶活性。

切口平移法
：目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。

Kle now
酶的基本用途：
1
】补平由核酸内切酶产生的
5
’粘性末端< br>；
2
】
DNA
片段的同位素末端标记；

3
】
cDNA
第二链的合成；

4
】双脱氧末端终止法测定
DNA
序列

Klenow片段：保留
5
→
3
’聚合酶活性和
3
→
5‘外切酶活性
；丧失了

5
→
3
‘的核酸外切酶活性。

T4-DNA
聚合 酶的基本用途：
1
】切平由核酸内切酶产生的
3
’粘性末端
；
2
】
DNA
片段的同位素末端标记

T4-DNA
酶的基 本特性：
1
】
5
’→
3
’的
DNA
聚合酶 活性和
3
’→
5
’的核酸外切酶活性；

2
】在无
dNTP
时，可以从任何
3
’
-OH
端外切；

3
】只有一种
dNTP
时，外切至互补核苷酸暴露时停止；


4
】在四种
dNTP
均存在时，聚合活性占主导地位；
5
】外切酶活性比
Klenow
酶高
100
～
1000
倍。

反转录酶：
依赖于
RNA
的
DNA
聚合酶

基本特性（用途）
：
1.
以
RNA
为模板聚合
cDNA< br>链

；
2.
双向外切
DNA- RNA
杂合链中的
RNA
链

S1
核酸酶的基本反应（用途）
：

（
来源于稻谷曲霉菌； 催化反应需
Zn2+
和酸性条件
pH4.0
—
4.5
）
1
）内切单链
DNA
或
RNA
；
2
）内切带缺口或缺刻的双链
DNA
或
RNA
；
3
）在
DNA
上定位
RNA

Bal31
核酸酶：
单链内切、双链外切的核酸酶；运用于诱变育种。
末端脱氧核苷酰转移酶（
TdT
）基本特性：
不需要模板的
DNA
聚合酶，随机掺入
dNTPs

1
来自小牛胸腺的小牛肠碱性磷酸酶（
CIP
）
2

来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（
BAP
）
碱性磷酸酶：

○
；
○
。

它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使
DNA
或
RNA
的
5
’磷酸变为
5
’
- OH
末端。





第三章


基因工程载体

1
、载体
：在基因工程操作中，把能携带外源
DNA
进入受体细胞的
DNA
分子。

**2
、基因工程对载体的要求（理想质粒载体的必备条件）
：

（
1
）在宿主细胞内能独立复制

（
2
）有选择性标记

（
3
）分子量小，拷贝数多

（
4
）有一段多克隆 位点，外源
DNA
插入其中不影响载体的复制

（
5
）容易从宿主细胞中分离纯化

载体的基本条件：
①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制；②

具有合 适的限制性核酸内切酶位点；③具有合适
的选择性标记基因，用来筛选重组体
DNA
。

3.
载体的种类：
质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒 载体、人工染色体、
（柯斯质粒、动物病毒）

特点：
◆载体
DNA
是单个复制单元，在宿主细胞内应具有独立复制能力；◆含有多种限制行内切酶的单一切点；

◆分子量尽可能小，便于细胞中分离纯化，离体条件下操作；◆载体内有不影响其复制，生长的非必要区 域；



◆具有多种选择性标记。

*
构建基因 文库常用的载体：λ
载体系列、
cosmid
（柯斯质粒）载体、
YAC（酵母人造染色体）
、
BAC
（细菌人造染色体）
、
P1
源人工载体

第一节


质粒载体






质粒：
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状
DNA
分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中

组成部分：复制必需区、
、选择标记基因、限制性核酸内切酶位点（克隆位点）
生物学特性：
分子小、编码基因少、双链环状闭合。
（酵母的?杀伤质粒?是
RN A
）

空间构型：
①

共价闭合环状
DNA
（
SC
）
，呈超螺旋②

开环
DNA
（
OC
）
，一条链上有一至数个缺口

③

线形
DNA
（
L
构型）
，呈负超螺旋

*
电泳速率：
SC- DNA
最快、
L-DNA
次之、
OC-DNA
最慢

二、质粒的类型

1
、接合型质粒
:
能自我转移；带有自我 复制所必需的遗传信息；带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：
F
质粒（ 性质粒、或
F
因子）








严紧型质粒
;
不符合基因工程的安全要求

2
、非接合型质粒
:
不能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；但失去了控制细 菌配对和质粒接合转移的基因（缺
乏转移所需的
mob
基因）
，因此不能从一 个细胞转移到另一个细胞。
如：
R
质粒（抗性质粒）
、
Col
质粒
（大肠杆菌素
对不带
Col
质粒的大肠杆菌有毒。
Col质粒或
R
质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒）













松
弛型质粒
;
符合基因工程的安全要求

三、质粒的复制 类型
---
松弛型质粒
:
拷贝数多，有
10
—
60
份拷贝





严紧型质粒
:
拷贝数少，只有
1
—
3
份拷贝

四、质粒载体的构建

1.
天然质粒的局限性

1
）分子量大，拷贝数低
：第一个用于基因克隆的天然质粒
pSC101
，分子长
9.09kb
，属严紧型质粒；但只有
Tetr
一个
选择性标记；分子质量大，拷贝数低

2
）筛选标志不理想：
ColE1
质粒筛选标志是大肠杆菌素
E1
；

colicin E1
能杀死不含
ColE1
质粒的菌，
形成
?噬菌斑?
。

2.
质粒载体必须具备的基本条件

1
）具有较小的分子量和较高的拷贝数




2
）具有若干个限制性内切酶的单一酶切位点


3
）具有两种以上的选择标记基因








4
）具有复制起点（
ORI
）


5
）缺失
mob
基因






















6
）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达

3.
质粒的选择标记及其工作原理：
（
1
）选择标记－抗性基因

氨苄青霉素抗性（
Ampr
）
青霉素的衍生物；通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应 ，杀死生长的细菌

氯霉素抗性




（
Cmlr
）
通过与
50S
核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽 键的形成，杀死生长的细菌

四环素抗性




（
Tetr
）
通过与
30S
核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成 并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。

链霉素抗性




（
Strr
）
通过与
30S
核糖体亚基结合，导致
mRNA
错译。杀死细菌。

卡那霉素抗性


（
Kanr
）
通过与
70S
核糖体结合，导致
mRNA
发生错 读。杀死细菌

4.
人工构建的质粒载体的类型

（
1< br>）高拷贝数的质粒载体：
如
ColE1
、
pMB1
，适合大量 增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。

（
2
）低拷贝数的质粒载体： 如
pSC101
，不适合大量扩增
DNA
用；

（
3
）失控的质粒载体：属温度敏感型复制控制质粒，如
pBEU1
、
pBEU 2
（
4
）插入失活型质粒载体：
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基 因内部。

（
5
）正选择的质粒载体：
如
pUR2
、
pTR262
；直接选择转化后的细胞；目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体；只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

（
6
）表达型质粒载体：
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物


第四章

分子基本操作技术

*1
、
DNA
的提取方法
:
最常用的是碱抽提法。

1
闭合环状的质粒
DNA
，在变性 后不会分离，复性快；
○
2
染色体线性
DNA
和或有缺口的质粒DNA
变性后双
原理：○
链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—
SDS
复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

步骤
：溶菌→→破膜 ，蛋白质和
DNA
变性→→中和
(
用
NaAc)
→→离心 除去沉淀→→纯化
DNA
（酚
-
氯仿抽提）→→
沉淀
DNA
2
、三种电泳的区别和适用范围









【
**
电洗脱槽
适用于回收大片段
DNA
】

琼脂糖凝胶电泳：
（水平）分离范围广，分辨率低



脉冲电场凝胶电泳：
适用于超大分子量的
DNA
电泳

聚丙 烯酰胺凝胶电泳：
（垂直）分辨力高，用于核酸，蛋白质分离，
DNA
序列分析

3
、核酸的分子杂交：
1
）
Southern blot
【用
DNA
（或
RNA
）探针检测
DNA
样品】

2
）
Northern blot
【用
DNA
（或
RNA
）探针检测
RNA
样品】

3
）原位杂交【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变，可以直接找出阳性菌落】


第六章

目的基因的获取和基因文库构建

第一节


基因组
DNA
片断化

1
、限制性内切酶法：优点：
由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。



缺点：
目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。

2
、随机片断化：
（
1
）限制性内切酶局部消化法；
（
2）机械切割法：超声波、高速搅拌

3
、化学合成目的基因方法：
磷酸二 酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。

化学合成
DNA
片断的组装方法：互补连接法、互补延伸连接法

4
、寡聚核苷酸化学合成的优点：

1
直接合成基因；
○< br>2
合成引物（
20mer
左右）
3
合成探针序列；
○
4
定点突变合成；
○
5
合成人工接头或衔接物。

○
；
○
5
、目的基因的获取方法：
核酸杂交法、差示杂交法、
PCR
筛选法、表达文库的免疫学筛选。

第二节


基因文库构建

1
基因文库：
是用分子克隆方法将某种生物或其组织 细胞的所有
DNA
片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行保存
的克隆集合。

2
构建步骤：
1
】染色体
DNA
大片段的制备：①物理 切割法：超声波、机械搅拌；②酶切法：局部消化。

2
】载体与基因组
DNA
大片段的连接：①粘性末端直接连接；

②人工接头法；③

同聚物加尾。

构建步骤：
克隆载体制 备
----
大分子基因组
DNA
分离
----
插入片段制备
----
插入片段与载体连接
----
连接产物宿主菌转化
----
基因组
DNA
文库生成。

3
基因组文库的大小：
一个文库要包含
99%
的基因组
DNA
时所需要的克隆数目。

N=ln(1-p)/ln(1-f)
【
p:

文库包含了整个基因组
DNA
的概率（
99%
）
f: 插入载体的
DNA
片断的平均长度占整个基因
组
DNA
的百分数


N
：
所需的重组载体数
（克隆数）
】
；
【
或
N=4.61*G/f


G
为基因组大小


f
：
基因组片段平均长度】

4
、
cDNA
文库：
利用某种生物的总
mRNA
合成
cDNA
，
再将这 些
cDNA
与载体连接，
转入细菌细胞中进行保存和扩增，
称
cDN A
文库。

以
mRNA
为模板逆转录出的
DNA
称
cDNA

特点：
1
）不含内含子序列；
2
）可以在细菌中直接表达；
3
）包含了所有编码蛋白质的基因；
4
）比
DNA
文库小的多，容易构建。

构建步骤：
1
）总
RNA
提取（商业化的 试剂盒
kit
）
；
（
2
）
mRNA
的分离 纯化（纤维柱，
NaCl
洗脱）

3
）
cDNA
的合成：①

cDNA
第一链合成

②

降解
mRNA
模板

③

cDNA
第二链合成

④去掉发卡结构

构建步骤：
mRNA
的提取
-----cDNA
克隆载体的选择
-----cDNA< br>克隆片段的获得
----cDNA
文库的生成。