基因工程知识要点

2021年2月28日发(作者：鼻子脱皮)
第一章

1.
基因工程
:
是在分子水平上进行的遗传操作， 指将一种或多种生物体（供体）的基因或基
因组提取出来，
或者人工合成的基因，
按照 人们的愿望进行严密的设计，
经过体外加工重组，
转移到另一种生物体
（受体）
的细胞内，
使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2
.基因工程的基本过程为哪些？
切
—
接
—
转
—
增
—
检

①

获得目的基因：从供体细胞分离出基因组
DNA
，用内切酶将外源
DNA
切开。
——
切（同
时选择 运载目的基因的载体）②

目的基因与载体
DNA
拼接：用
DNA< br>连接酶将含有外源基
因的
DNA
片段接到载体分子上，
形成
D NA
重组分子。

——
接

③

重组体分 子导入受体细胞：
借助于细胞转化手段将
DNA
重组分子导入受体细胞中。
— —
转











































④

短时间培养转化细胞，
以扩 增
DNA
重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。




——
增⑤

筛选和鉴定转化细胞，
获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。







——
检

3.
哪些基因是真核生物特有的？

①

假基因：核苷酸序 列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的
失活基因。

②

基因家族：由功能相关的基因成套组合形成

③重复序列

哪些是原核生物特有的：
插入序列。哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因

第二章

1.
寄主细胞控制的限制与修饰

宿主控制限制
——
核酸限制性内切酶

宿主控制修饰
——
修饰的甲基转移酶

以λ
(k)
噬菌体侵染
B
菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。



（简述寄主控制的限制与修饰现象。

?

大多数细菌的噬菌体侵染 都存在着一些功能性障碍。所谓的寄主控制的限制与修饰
现象简称（
R/M
体系）。
R/M
体系：寄主是由两种酶活性配合完成的

一种是修饰的甲基转移酶
——
修饰

另一种是核酸内切限制酶
——
限制

R/M
体系的作用：

?



保护自身的
DNA
不受限制；

?



破坏外源
DNA
使之迅速降解；

2.
简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（
1
）Ⅰ型酶基本特性


①

有内切酶活性和甲基化酶活性
——
互斥②

需要
ATP、
SAM
（
S
—腺苷甲硫氨酸）和
Mg
2+
辅助因子；③

EcoB
和
EcoK
是由三种 不同亚基组成。γ多肽链：特异性亚基，识别
DNA
序
列的活性。β多肽链：修饰亚基 ，具有甲基化酶活性。α多肽链：限制亚基：具有核酸内切
酶活性④

有特定的识别位点⑤

切割方式：结合在识别位点，以滚环形式沿着
DNA< br>分子转
位，从距识别位点
5 ’
一侧几千
bp
处随机切割分子，无特异性。

（
2
）Ⅱ型酶：
①有内切酶活性和甲基化酶活性
——
分开反应②能识别专一的核苷酸序列 ，
并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构
（那项具有回文结构：
识 别位点
的
DNA
序列呈双重旋转对称

）
④切割可形成两种 核苷酸切割末端
————
粘性末端和平末端。
粘性末端定义

：指
DNA
分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，
能
通过互补碱基间配对而重新环化起来
。

（
3
）Ⅲ型酶：
①

由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活
性

②

需
Mg 2+
、
ATP
、
SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，
并在这一顺序的
3’
端
24
～

26bp
处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的

4.
同尾酶
：
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内 切酶。利用同尾
酶可使切割位点的选择余地更大。

同裂酶：
指来源不同但识 别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶进行同样的切割，
产生同样的
末端。但有些同裂酶 对甲基化位点的敏感性不同。

星号活性：
同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一 性发生改变，
即酶切位点专一性改变
的活性。包装上标
“
＊
”
注明。


缺口平移、取代反应的概念

DNA
缺口平移：
在
DNA
分子的单链缺口上，
DNA
聚合酶Ⅰ的
5
’

→

3
’
核酸外切酶活性和聚
合作用可以同时发生。

（概念：
当外切酶活性从缺口的
5
’
一侧移去一个
5
’
核苷 酸之后，
聚合酶作用就会在缺口的
3
’
一侧补上一个新的核苷酸，但
Pol
Ⅰ不能在
3
’
-OH
和
5
’
-P< br>之间形成一个键，随着
5
’
一侧的
核苷酸不断移去，

3
’
一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着
DNA
分子合成的方向移动。
）

②

用途：通过
DNA
缺口转移，制备供核酸 分子杂交用的带放射性标记的
DNA
探针。

取代反应：
如果在反应 混合物中仅存在一种
dNTP
，则此酶的
3
’
→
5
’

的外切酶活性将从
ds
DNA
的
3
’
端降解，直到互补于该
dNTP
的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代反
应 。

6
.
各
DNA
聚合酶的基本特性及其区别；

（
1
）大肠杆菌
DNA
聚合酶Ⅰ（
Pol
Ⅰ）的酶 活性

①


5
’

→

3
’
的聚合酶活性：需
Mg2+
②


5
’

→

3
’
的外切酶活性：可以从游 离的
5
’
-OH
末端水解
DNA
分子
(
修 复作用
)
③


3
’

→
< br>5
’
的外切酶活性（较低）
：从
DNA
链的
3
’
-OH
末端向
5
’
水解
DNA(
校对作用)
用途：
主要功能参与
DNA
的合成，起到修复作用；
Pol
Ⅰ同
DNA
分子克隆的关系最为密切。

（
2
）
Pol
Ⅰ的
Klenow
片断

①

5
’
→
3
’
的聚合酶活性；


②

3
’
→
5
’

的外切酶活性

③

无
5
’
→
3
’

外切酶活性。

Klenow
片断的主要用途：


①

修补经限 制酶消化的
DNA
所形成的
3
’
隐蔽末端；



②

标记
DNA
片断的末端；


③

cDNA
克隆中的第二条链
c
DNA
的合成；



④

DNA
序列的测定。

（
3
）
Pol
Ⅱ（参与
DNA
修复过程）

酶活性：①

5
’
→
3
’
的聚合酶活性： 要求模板是双链
DNA
，中间有空隙的单链
DNA
部分，且
空隙部分 不长于
100 bp
；


②

具有
3
’
→
5
’

的外切酶活性，无
5
’
→
3
’

外切酶活性；


③

主要在
DNA
的损伤修复中有一定的作用

（
4
）
Pol
Ⅲ

①

聚合作用：是细胞内
DNA
复制所必需的；②

3
’
→
5
’

的外切酶活性，底物是单链
DNA
；

③

5
’
→
3
’

外切酶活性，底物是单链
DNA
。

（
5
）
T4 DNA
聚合酶

①

5
’
→
3
’
的聚合酶活性；

②

3
’
→
5
’

的外切酶活性；

③

无
5
’
→
3
’

外切酶活性；

④

取代反应
:
在只有一种
dNTP
时，外切至互补核苷酸暴露时停止；

（
6
）
T7 DNA
聚合酶

①

5
’
→
3
’
的聚合酶活性；

②

3
’
→
5
’

的外切酶活性（是
klen ow
片段的
1000
倍）
；

③

无
5
’
→
3
’

外切酶活性；

（
7
）耐热
DNA
聚合酶（
T
aq DNA
聚合酶）
（选择题）


①

具耐高温的特 性，最适活性温度为
72
℃，连续保温
30min
仍有活性，一次加酶即可满
足
PCR
反应全过程的需求；

②

Mg
2+
依赖酶；③具有聚合酶活性；④具有
5’
→
3’
外切酶
活性，无
3’
→
5’
外切酶活性

⑤

SDS
完全抑制其酶活性。

（
8
）反转录酶

依赖
RNA
的
DNA
的聚合酶。







α多肽链
——
具有反转录酶活性和
RNase H
活性；







β多肽链
——
具有以
RNA-DNA
杂交分子为底物的
5< br>’
→
3
’
脱氧核酸外切酶活性。
















以
mRNA
为模板合成
cDNA
； 在反转录酶作用下，水解掉
RNA
链，再以
cDNA
为模板合成第
二 条
cDNA
。

7
.
连接酶所需的条件——供能分子、磷酸基团和羟基。

概念：< br>能够催化两条
DNA
链之间形成磷酸二酯键的酶。即能够将
DNA
链上 彼此相邻的
3’
-
羟基（

OH
）和
5’
-
磷酸基团（
-P
）
，在供能分子的作用下，形成磷酸二酯键。

需要三种成分参与：
3’
-OH
，
5’
-P
，提供 能量的分子

供能分子
：
NAD+
（烟酰胺腺嘌呤二核酸）
——
在

等细菌中选用

ATP
（腺苷三磷酸）
——
动物细胞、噬菌体中选用

注：①

只能连接缺口（
nick
）
；②

不能连接裂口（
gap
）
；

③

而且被连接的
DNA
链必须是双螺旋
DNA
分子的一部分。

8
.
缺口：
在双链
DNA
的某一条链上两个相邻核苷酸之间 失去磷酸二酯键所出现的单链断裂。

裂口
：在双链
DNA
的某一条 链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。

9
、碱性磷酸酶：
将
DNA
末端的
5
’端磷酸基除去，使其
5
’端变成
3羟基，能防止自身环
化。

作用：
（
1
）
去除
DNA
和
RNA
的
5”
--
磷酸基，
然后 在
T4
多聚核苷酸激酶催化下，
用
[γ—
32P]ATP
进 行末端标记，继而进行序列分析。
（
2
）去除载体
DNA5”
--< br>磷酸基，防止自身环化，降低本
底，提高重组
DNA
检出率。


发夹结构：

10
、末端转移酶特性：
①

催花
dNTP
添加到
3’
-OH
端，且不需模板；

②

需
Co 2+
。

用途
：①

给载体或
cDNA
加上互补的同聚尾；②

标记
3’
末端。

第三章

1
、基因载体 ：
离开染色体的外源
DNA
不能复制，而插入的外源
DNA
可作为复 制子的一部
分在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。


2
、报告基因：有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可依据报告基因从其他细胞中
识别 区分甚至挑选出来。

2
、载体应具备的特性：

①
能在宿主细胞内进行独立和稳定的
DNA
自我复制，
插入外源基因后，
仍 保持稳定的复制
状态；②

易于从宿主细胞中分离，并行纯化；③

载体
DNA
序列中有单一的酶切位点，并
位于
DNA
复制的非必需区 内；④

具有能够观察的表型特征，如报告基因（遗传标记）
，插
入外源DNA
后，这些特征可以作为重组
DNA
选择标志。

3
、载体的致死效应：
利用载体进行克隆时，有时可能对大量的克隆化基因和克隆化基因产
物可 能有害，宿主细胞呈现致死效应。如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。

3
、
R1
质粒和
Col E1-K30
质粒



中

奇异变形杆菌中

R1
质粒

严紧型

松弛型

Col E1-K30
松弛型

严紧型

4
、质粒构型：常见的构型
: SC > L > OC
A.
共 价闭合环形
DNA(cccDNA):
呈现超螺旋的
SC
构型
B.
开环
DNA(ocDNA):
即
OC
型。

C.
线性
DNA(lDNA):
即
L
型。

根据寄主细胞所含的拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。

5
、质粒的种类

F
质粒：又叫
F
因子、性质粒或 致育质粒。是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着
19
个转移基因。

R
质粒：又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。

Col
质粒：产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。属非结合质粒。

6
、
Col E1
质粒的迁移作用
：
由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移的过程。

其中参与迁移的有两种基因：

bom
基因：位于
Col E1DNA
上的特异位点

mob
基因：
Col E1
质粒特有的，其编码的核酸酶作用于
bom
位点

7
、细菌质粒的不相容性

在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不亲和性。

是指在没有选择压力的情况下，
两种亲源关系密切的不同质粒，
不能够在同一个寄主细胞系< br>中稳定地共存的现象。

8
、质粒的报告基因应用类型：插入失活效应；α
—
互补

简述如何应用插入失活和α
-
互补（蓝白筛选）来筛选重组子

pB R322
质粒载体有
:
抗氨苄青霉素基因
(ampr);
抗四环素基 因
(tetr)
②

α
—
互补：
LacZ
（半乳糖苷酶基因）有两个主要的亚基，α亚基

和

ω亚基，

α

与

ω

相结合就能表现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物
X-Gal
变成蓝色。

ω片段基因
——
coli
基因组




α
-
肽基因
——
质粒

?

将含有α
-
肽的质粒转化到
coli
上（

α
-
互补）
，形成蓝色菌落；

?

插入外源基因，使α
-
肽编码区被破坏，
LacZ
失活则形成白色菌落。





利用α
-
互补（蓝白斑筛选）进行重组子的筛选。

9
、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。

（
1
）减小分子量：可容纳外源
DNA
更长；

（
2
）改造内切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）
；

（
3
）
插入外源基因后，
较易导入宿主菌内复制和表 达，
且不会因接触而转移到另一个细菌；

（
4
）具有一个或几个报告基因。

克隆载体：复始起始点、遗传标记、多克隆位点

10
、
pBR32 2
和
pUC
质粒的各组成部分的来源分别是什么？

（
1
）
pBR322
主要组成部分的来源

①

亲本：
pMB1
和
pSF2124




②

ampr
基因来源于
pSF2124
；

③

tetr
基因来源于
Psc101;




④

复制起点（
ori
）
Col E1
11、
穿梭质粒
：
是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在 两种
不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。

专


题

——核酸分子的提取及核酸凝胶电泳

2
、
简述提取质粒
DNA
的原理及步骤。

碱变 性法原理：
利用染色体
DNA
与质粒
DNA
的变性与复性的差异而达 到分离的目的。

步骤：
①材料的准备

②破碎细胞或包膜，使内容物释放


③核酸分离、纯化

④沉淀或吸附核酸，去除杂质



⑤核酸溶解在适量缓冲液或水中

3
、

如何防止
RNase
污染？

①

塑料器皿用0.1%DEPC
水溶液浸泡
12h
以上，高温灭菌后，
180
℃烘干
6h
以上。②

在
超净工作台上操作。

③

操作时带一次性手套和口罩。



④

提取缓冲液中加入
RNase
抑制剂。

1< br>、温和噬菌体：
既可引起宿主细胞的裂解死亡，又可将其核算整合到细菌染色体上，使细
菌细胞继续生长繁殖，并被溶溶原化的噬菌体。
























烈性噬菌体：
将噬菌体感染的记住细胞转变成为噬菌体的
“
制造厂
”
，能产生出大 量子代噬
菌体。

溶原化：
用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程。

噬箘粒：
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒载体。

柯斯质粒：
一类由人工构建的含有λ
DNA
的
cos
序列和 质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
载体，也称粘粒、柯斯载体。

4
、

PAGE
、琼脂糖凝胶电泳和脉冲电泳的区别及其应用范围。

电泳技术


琼脂糖凝胶电泳

用途

区别

检测总
DNA
或总
RNA

的完整 性、
对
PCR
产物
分辨
100bp~50kb
的核
进行检测以及对核酸进
酸片段

行回收和纯化

聚丙烯酰胺凝胶电泳

生物多样性检测以及亲
分辨
1bp~1000 bp
的核
子鉴定等

酸片段

脉冲电场凝胶电泳

分离大分子量的
DNA
分
分子

辨



















>50kb
的核酸片段

2
、λ噬菌体的繁殖方式

①

溶菌性方式：λ噬菌体利用宿主的酶类和原料，λ
DNA
复制成 子代λ
DNA
，并装配呈子
代λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。

②

溶源性方式：
感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，
噬菌 体
DNA
是整合到寄主细胞染
色体
DNA
上，成为细菌
DN A
的一个组成部分。

3
、λ噬菌体的类型及体外包装程序

（二）体外包装程序

①

包装反应的底物，按照滚环复制机理合成 多连体形式的
DNA
，在具备噬菌体头部前体的
条件下，从
cos
位 点处被切割成单体分子。

②

将线性单体分子装填到头部外壳里，由于具有粘性末端而发生环化。

③

把头部和分别组装的尾部结构连成一体，形成成熟的λ噬菌体颗粒。

4
、
M13
载体的优点和用途
;
优点：
①

只含单链
DNA
，
因此可用作对
DNA
测序的模板及其它基因克隆实验，
如异源双链
DNA
分析，互补RNA
的分离及
DNA
序列分析等；

②


可用来产生单链的
DNA
探针以选择和分离互补的
RNA
；③

RF
型是双链
DNA
，便于限
制酶的识别和切割；

④

RF
型
DNA
经包装后分泌到细胞外而不溶菌；⑤

不存在包装限制问题。

用途：
①

制备测序用单链
DNA
模板；②

用于制备杂交探针；③

用于定点突变。

6
、质粒、λ

噬菌体和柯斯质粒的包装限制。

（
1
）λ噬菌体
的包装能 力控制在为野生λ噬菌体
DNA
长度（约
48.5 kb
）的
75%-105%
。

①

蛋白质外壳容纳
DNA
的能力②

λ噬菌体载体克隆外源
DNA
的能力

（
2
）柯斯 质粒：
可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重
组
DN A
导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒
DNA
的形式存在于细胞内。

克隆的外源基因可达
45kb
，比λ噬菌体大许多。由于包装限制的缘故， 存在最低限值
（
>30kb
）
。
:
噬箘粒特点：

?

噬菌粒载体的分子量较小，约
3000bp
；

?

既有质粒的复制起点又有噬菌体的复制起点。
在寄主内，
可以按 正常的双链质粒
DNA
形式复制，形成的双链
DNA
既稳定又高产，具有常规 的质粒特性（选择性标记、多
克隆位点等

?


在辅助噬 菌体的存在下，
可进行噬菌体的繁殖，
产生单链的子代噬菌体，
包装成噬
菌体 颗粒后被挤出寄主细胞。

?

用噬箘粒克隆
DNA
进行测序，免去从质粒到噬菌体这一亚克隆步骤。
（分子量小、克隆能力大；能稳定遗传；可用来制备单、双链
DNA
。
）

（一）聚合酶链式反应（
PCR
）

1
、

原理
：
双链
DNA
分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的< br>DNA
分子，然
后
DNA
聚合酶以单链
DNA
为模板 ，引物与互补
DNA
结合后，经单链杂交复性，并利用
反应混合物中的四种脱氧核苷三 磷酸（
dNTPs
）按
5’
→
3’
方向将引物延伸，合成新 生的
DNA
互补链。

2
、

反应过程：
①模板
DNA
的变性：模板
DNA
经加热至
94
℃左右一定 时间后，使模板
DNA
双链或经
PCR
扩增形成的双链
DNA
解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮
反应作准备；②

模板
D NA
与引物的退火
(
复性
)
：模板
DNA
经加热变 性成单链后，温度
降至
55
℃左右，引物与模板
DNA
单链的互补序 列配对结合；③引物的延伸：
DNA
模板
--
引物结合物在
T
aq DNA
聚合酶的作用下，以
dNTP
为反应原料，靶序列为模板，按碱
基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板
DNA
链。




变性：通过热处理将待扩增模板的双链
DNA
变性裂解成单链
DNA;



退火：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物杂交结合；




延伸：在适当条件下，
DNA
聚合酶使引物延伸，产 生新的双链。
72
℃

3
、反应体系和反应条件

PCR
反应体系：模板：
DNA
；引物：
P1

P2
；
DNA
聚合酶：
T
aq
；原料：
dNTP< br>；反应缓冲液；
辅助因子：
Mg2+
Mg2+
的作用：①
Mg2+
是
DNA
聚合酶的激活剂。适宜浓度为
0.5-2.5mmol/L
反应体系。

①

Mg2+
浓度过低会使
T
aq
酶活性丧失、
PCR
产量下降；

Mg2+
过高影响反应特异性。

②

Mg2+
可 与负离子结合
,
所以反应体系中
dNTP
、
EDTA
等的浓 度影响反应中游离的
Mg2+
浓度。

4
、
引物二聚体：一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双