最新基因工程课后习题答案

2021年2月28日发(作者：珍珠疹图片)
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2
．质粒
DNA
和病毒（噬菌体）< br>DNA
作为载体的主要特征是什么



为外源基因提供进入 受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外
源基因提供在受体细胞 中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择
标记

3
．如何理解质粒的不相容性及其在
DNA
重组克隆过程中的运用意义



质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳 定存在于同一受体细
胞内
.

4
．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和
cos
质粒的不同用途

表达质粒
:
在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体 结合位点序列（
SD
）
序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外 源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以 及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞
中复制并检测。

探针质粒：用来筛选 克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或
终止子），只有含有 启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小
直接反应了克隆进入 的调控元件的强弱。

cos
质粒：
人工构建的含有
λDNA
的
cos
位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。具有大的装载量，
可以用于 构建基因组文库。

5
．
II
类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么

分子量较小的单体蛋白，双链识别和 切割活性仅需
Mg
，识别位点为
4-6
个
bp
的回文序列， 切割位点在识
别序列中或靠近识别序列

7
．
KLenow
酶与大肠杆菌
DNA
聚合酶
I
在结构和功能上的主要区别

DNA
聚合酶
I
包括大片段
(klenow
片段
)
和小片段

功能上：
DNA
聚合酶
I
比
klen ow
酶多了
5’→3’核酸外切酶活性，
两者都具有
5’→3’DNA
聚合酶活性和
3’→5’核酸外切酶活性。

8
．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？


温度、盐 度等物理因素，
DNA
样品纯度，
DNA
甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓 冲液性质，甘油和
微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性

9.
如何理解粘性末端比平头末端更容易连接

在退火条件下，粘性末端的连 接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，
速度也慢。因为一个平头末端 的
5’磷酸基团或
3’羟基与另一个平头末端的
3’羟基或
5’磷酸基团同时
相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度比粘性末端慢
10-100
倍。

11
．为什么外源
DNA
难以转化野生型的微生物受体细胞
< br>野生型细菌有针对外源
DNA
的限制和修饰系统，外源
DNA
会被识别 ，从而被降解，要选择限制系统缺陷型
的受体细胞（限制缺陷型）
；外源基因克隆、扩增以及表 达是建立在
DNA
重组分子自主复制的基础上的，受
体细胞必须选择体内同源重组缺陷 型的受体细胞（重组缺陷型）
；用于基因工程的受体细胞必须对重组
DNA
分子具有较 高的可转化性，
利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，
从而提高其转化率
（转化 亲和型）

13
．
简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略

载体遗传标记检测：抗药性检测，营养缺陷型检测；显色筛选

2+
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克隆
DNA
序 列检测：限制性酶切图谱法，菌落原位杂交法，
PCR
扩增法

14
．
探针、引物、接头的物质基础和用途分别是

探针
:
小段单链
DNA
或
RNA,
序列可以是已知的或未知的，带有标记（ 放射性
/
非放射性）
，用于检测与其互
补的核酸序列；

引 物：小段单链
DNA
或
RNA
，序列是已知的，长度为
16-30b p
，作为
DNA
复制的起点

接头：平头双链
DNA
，更换粘性末端

15
．
简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围

鸟枪法：将某 种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的
DNA
片段，分别连接到载体
DNA
上，转化
受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。为保证覆盖整 个基因组，需要测
远远超过基因组大小的序列；
适合较小的基因组；
测序后需要填补一 些空白；
适合没有重复序列的基因组，
如果有大量的重复序列，不能保证正确的组装。

cDNA
法：获得
mRNA
，除去内含子

PCR
法，知道基因的两侧序列或中间序列

化学合成法，知道全基因序列，小片段连接法，补丁延长法，大片段酶促法

16
．
简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。

基因文库：基因组文库和
cDNA
文库

基因组文库：把某种生物基 因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个
群体即为这种生物的基因组文库 。

cDNA
文库：由某个生物体的某个器官或组织
mRNA
反转录 形成的总
cDNA
，构建形成的基因文库

一个生物体的
基因组DNA
用
限制性内切酶
部分酶切后，将酶切片段插入到
载体
DN A
分子中，所有
这些插入了基因组
DNA
片段的载体分子的集合体，将包含这 个生物体的整个基因组，也就是构成了这个
生物体的
基因文库
。

构 建技术：载体：
λ
-DNA
和考斯质粒，装载量大（待克隆
DNA
随 机片段的大小应与所选用的载体装载量
匹配）

用机械断裂（超声波冲击）或限制性内 切酶部分酶解整个基因组
DNA
，得到大量的
DNA
片段，将这些片
段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有
特定的基因组
DNA
片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。< br>
cDNA
构建技术：

载体：普通质粒（表达型），受体细胞：大肠 杆菌（繁殖迅速，易于保存，克隆操作简便，转化效率高）

提取细胞内总
RNA，用
Oligo(dT)
探针分离其中的
mRNA
，经反转录形成
cDNA
，将单链
cDNA
变成双链，
用合适的限制性内切酶进行酶切，与 载体相连，转化宿主菌，挑选阳性克隆，形成文库

第三章

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1
、简述外源基因在大肠杆菌中高效表达的基本原理。

强化蛋白质生物合成，抑制蛋白产物降解，维持或恢复蛋白质特异性空间构象

启动子 ：选用强启动子，
-10
区和
-35
区两个六聚体盒的碱基组成以及彼此的间 隔长度（
17bp
）
，可控性启
动子（
Lac
启动子）
终止子：强终止子，
rrnT
1
T
2
，
否则 会形成长短不一的
mRNA
混合物

SD
序列：5’
-UA A
GGAG
G-3',
考虑
SD
序列与翻译起始密码子之间的碱基组 成

密码子：更换外源基因中不适宜的相应密码子；将与外源基因密码子相关的
tRN A
编码基因同步克隆。

将外源基因至于这个可控的基因框架内

5
、
简述外源基因在大肠杆菌中几种主要的表达方式及其优缺点。

包含体型异源蛋白的表达：

优点：
1.
简化外源基因表达产物的分 离操作
-
离心
,2.
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
--- -
蛋
白酶不再构成威胁

缺点：包含体中的蛋白质中的氨基酸序列不具备正确的折叠结构，无活性

分泌型异源蛋白的表达：

a)

b)

c)

通过蛋白质
N
端信号肽将蛋白质通过运输或分泌的方式定位在 细胞周质（内膜与外膜之间的空
隙）或直接分泌到培养基中的，称为分泌蛋白

一些蛋白分泌到胞外，会增加其稳定性

将大肠杆菌分泌型蛋白的信号肽与外源基因相 连，转化分泌型受体细胞，则可获得分泌在培养
基中的重组异源蛋白。

缺点：表达率 要比包含体方式低很多，且大肠杆菌对真核生物的蛋白质分泌机制不健全，难以表达。

融合型异源蛋白表达：

a)

b)

外源基因< br>+
受体菌自身蛋白基因
→
融合基因
→
表达融合蛋白（內源基因
N
端，外源基因
C
端）

优点：
1
）增加了稳定性





2
）便于体外纯化




3
）表达效率高

缺点：目的蛋白需要回收（需要裂解和进一步分离才能获得目的蛋白，还需要回收，成本较高）

10
、
简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式及解决途径

a)
不稳定主要两种形式

i.
ii.
b)
i.
ii.
iii.
重组
DNA
分子发生缺失、重排或修饰

重组分子从受体细胞中逃逸

细菌的限制和修饰系统

高效表达的重组蛋白，抑制细菌正常生长，诱导细菌产生应激反应。

不均匀分配

不稳定的机制：

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