基因操作原理

2021年2月28日发(作者：月见草油胶囊)
（这份材料根据老师给的
PDF
课件整理，仅供参考）


第一章

编码产生一种有生物学功能产物
---
蛋白质（多肽）或< br>RNA
所需信息的一段
DNA
称
基因
。

Include:
1.
编码蛋白质肽链或
RNA
所必需的核苷酸序列
(open reading frame)
2.
保证转录所必须的调控序列
(S-D)
3. 5
’
-
和
3
’
-
非翻译序列(leader and trailer)
4.
内含子
(intron)
Recombinant DNA
（重组
DNA
）
：是将一种生物体 （供体）的基因与载体在体外进行拼重组，
然后转入另一种生物体
（受体）
内，
使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状
的
DNA
体外操作程序，也称 为分子克隆技术。

这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。

两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

基因工程
是指 重组
DNA
技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大部分。
上 游
技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组
DNA
技术）
；而 下游技术则涉及到
基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。


Genetic
Engineering
（基因工程）

重组DNA
技术与基因工程的基本用途分离、
扩增、
鉴定、
研究、
整 理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、
构建生物的新性状甚至新物种大规
模生产生物活 性物质工程细胞。

Development of gene engineering
：

第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程

第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程

第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

第二章

目的基因的获得（

DNA
的准备）

1.
从基因组直接获得
-PCR
方法获得
3.
人工合成法


DNA
抽提的基本原理

?

1
获得细胞，裂解细胞

三种破壁、膜的方法比较：
非离子型去污剂法
较温和．适用于抽提
10kb
左右的质粒；而
煮< br>沸法与碱性
SDS
法
相对较剧烈．只能抽提小于
10kb
的质 粒，当然在熟练方法的前提下，
碱性
SDS
法
也能抽提较大的质粒。非离子型 去污剂的变性能力较弱，常用的
TritonX
—
100
等，常
用的 离子型去污别是
SDS
。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。

2
分离（质粒
DNA
与染色体
DNA
的分离）

3
纯化（去除
RNA
）

?

RNA< br>与
DNA
相比在化学及生化性质上有差别，
因此可选用
RNA
酶处理．
以保留
DNA
分子而专门
分解
RNA
。

3
纯化（去除蛋白）

?

常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。

PCR
的基本原理
：变性、复性、半保留复制

PCR
三步曲
：
1. DNA
热变性
90
～
97
℃
2.
引物退火
45
～
55
℃
3.
引物延伸
72
℃左右


- 1 -
How many copies?
1.
到第
3
个循环才有目的片断（指用长
DNA
作为模板）
.
2.
早期并不严格按
2
倍增长

9
3.30
循环时约有
1,073,741,764
个目的产物
(~1
×
10
).
4.
有约
60
不是目的长度的片断
.
5.
大于
35
个循环时不能明显增加产物量

进入平台期的原因
:
1.
反 应试剂用完
2.
产物之间相互退火
3. Taq
酶活性降低

优化
PCR
反应：

1.
引物的退火温度
. 2+
的浓度
.
3.
延伸时间
. 4.
模板和
Taq
的量

能否扩增
RNA?
?
Not
directly
—
the
DNA
polymerase
requires
a
DNA
template
and
will
not
copy
RNA.
?
mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase.
?
cDNA is a template for PCR
—
it need not be double-stranded.
TA
克隆：

1.
Taq< br>扩增
PCR
产物物末端加个
A
；
2.
可以与末端为
T
的载体直接连接

引物设计要求：
引物 长度在
20
个碱基左右；
.
引物
G/C
含量约
45
–
55%
；
2
条引物退火温度差
别不要超过
1
°
C
；引物内部最好没有反相互补序列；
2
条引物之间不能有互补序 列；引物内
部不能有重复序列。

PCR
存在的问题：

1 .
可信度（
F i d e l i t y
）

：
P C R
反应过程中的错配现象，给
PCR
克隆、变异导
入带来麻烦。

2.
扩增的
DNA
长度：一般扩增
1
～
2 kbp
以下的
DNA
片段。

3.
扩增的
DNA< br>量：对有些检测、克隆时，
DNA
量往往达不到要求。

4. PCR
扩增困难：当
DNA
富含
GC
或具有复杂二级结构时，
PC R
很难扩增。


反应速度：当急于得到实验结果时，
PCR
反应速度较慢。


2-3
分子杂交

1 Southern Blotting

2 Northern Blotting

3 Western Blotting
（一）
Southern Blot
基因组
DNA
与
DNA
探针的杂交

功能：

1
研究某一基因在基因组中的拷贝数

2
研究异源物种是否有类似基因（
ZooBlooting
）

?

原理：将待检测的
DNA
分子用
/
不用限制性 内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，
继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄 膜或尼龙膜上，
固定后再与同位素
或其它标记物标记的
DNA
或
RN A
探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，
则二者
通过碱基互补 的原理进行结合，
游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，
从而
显示出待 检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的
DNA
及其含量，了解基因的状态
,
如是否有点突变、扩增重排等。

Southern Blot Southern Blot
操作步骤：

DNA
→

琼脂糖电泳

→

印迹转移
→

预杂交
→

杂交（变性探针）
→

洗膜

→

放射自显影或显色

二、
Northern Blooting RNA
与
DNA
探针的杂交

功能：
1
分析
mRNA
的分子量大小

2
分析
mRNA
表达量


- 2 -
3
分析
mRNA
表达的组织分布

4
分析
mRNA
的发育表达化

5
研究
mRNA
的不同剪切方式

Northern blot
的步骤：

?

1 RNA
电泳（包括制备变性胶和
RNA
样品的处理）

?

2
转膜（把
RNA
从胶上转移到膜上）

?

3
杂交（用标记同位素的
DNA
探针与膜进行杂交）

杂交前一般要进行预杂交，消除非特异性杂交

?

4
洗膜、曝光、冲片

三、
Western Blot

蛋白与蛋白的杂交，如蛋白与抗体的杂交

功能：
1
分析蛋白的分子量大小

2
分析蛋白表达量

3
分析蛋白表达的组织分布

4
分析蛋白的发育表达变化

5
研究蛋白前体的后加工方式

WesternBlot
原理：< br>将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或
PVDF
膜上，
然 后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，
洗涤去除没有结合的特异性抗体后，
加入标
记的、
能识别特异性抗体的种属特异性抗体，
反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的< br>标记抗体，
加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，
观察有无特异性蛋白条带的出 现，
也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。


ELISA< br>原理
：
ELISA
的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表
面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，
酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学 活性，
又保留酶
的活性。
在测定时，
受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起 反应。
再加入酶标记的抗原或
抗体，
也通过反应而结合在固相载体上。
此时固 相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的
比例。
加入酶反应的底物后，
底物被酶催化 成为有色产物，
产物的量与标本中受检物质的量
直接相关，
故可根据呈色的深浅进行定 性或定量分析。
测定方法具有很高的敏感度
（
pg- ng/ml
水平），并且重复性好。

类型：（
1
）间接法测抗体

(2)
双抗体夹心法测抗原

(3)
竞争法测抗原


cDNA
法克隆目的基因的基本策略

双链
cDNA
的克隆

双链平头的
cDNA
通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：

1.
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

2.
平头两 端分别接同聚物尾，最好是
AT
同聚物尾，分子可这样重组通过加热局部变性和
S1< br>核酸酶处理回收插入片段

3.
加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收

cDNA
法克隆目的基因的局限性：

1.
并非所有的
mR NA
分子都具有
polyA
结构

2.
细菌或原核生物的
mRNA
半衰期很短

3.m
RNA
在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难

4.
仅限于克隆蛋白质编码基因


第
3
章基因工程酶的操作

限制性核酸内切酶
简称限制性内 切酶，是一类能识别双链
DNA
中特定核苷酸序列并具有
专一切割位点的脱氧核糖核酸 水解酶。


- 3 -
限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，< br>即由其属名的第一个字母
(
大写
)
与种名
的第一、
二 两个字母
(
小写
)
组成酶的基本命名，
若酶的产生菌由株系之分，< br>则有
4
个或
4
个以
上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株 系。如
EcoRI
来源于
RY13

BamHI
来源于
B.
amyloliquefaciens
已发 现的限制酶可以分为三类或称作三型：
I
、
II
、
III
型 。
他们在酶反应中所需要的辅
因子和切割
DNA
的位点都不相同，而且酶蛋白 分子的大小和组成上也有差别。


II
型限制酶的识别序列大多是具有双重 对称结构性结构
,
或称
回文序列
(Palindromic
Sequence)
大部分
II
型限制性内切酶的识别序列长度为
4-8
个核苷酸。
识别长度决定了剪切
DNA
的频
率（
1/ 4n
，
n
为识别的长度）。识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性
高。

限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构



切割位点专一

作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点；



产物具有特定的末端结构

当一个
DNA
分子被 限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。即一种限制
性内切酶切割任何
DN A
只产生一种固定形式的末端结构，
在
DNA
连接酶的作用下，
磷酸 二酯键
可以修复而成为一个重组的
DNA
分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。< br>


任何一种限制酶切割
DNA
链时，总是水解核苷酸
3’
、
5’
-
磷酸双酯键的
3’
位磷酸酯键，
使 产物的
5’
端带磷酸单酯基团，而
3’
为游离羟基。



由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构

①

平末端（
Blunt End
）指酶切片段为齐头末端结构。

②

粘性末端（
Cohesive End
）酶切后
DNA
片段末端带有
1-4
个核苷酸残基长度的单链结构，
而片段两端突出的单链具有互补的序列。

粘性末端又可分为
5‘
-
粘性末端与
3’
-
粘 性末

同裂酶：
有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，
其差别只在于当识别
顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内

切酶可以切割，另一种则不能。
例如
Hpa
Ⅱ和
Msp
Ⅰ的识别顺序都是
5
’……
CCGG
……
3
’，
如
果其中有
5
’
-
甲基胞嘧啶，则只有
Hpa
Ⅱ能够切割。这些有相同切点的 酶称为同裂酶（同切
酶或异源同工酶）。

酶反应条件



按手册或商品说明书

反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。常用的缓冲液选择
Tris-Hcl
。同时还
要加入
Mgcl2
和
2-
巯基乙醇。

反应温度：

一般限制性内切酶的反应温度是
37
○
c
。


- 4 -
酶活性单位：
1
个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的反应条 件下，
1
小时使
1
μ
g
λ
噬菌体
DNA
底物完全水解的酶量。但由于许多因素可影响内切酶的水解反应和用量，实际用量需比
所需用量 多加一倍左右。

在次理想条件下
,
一些限制性内切酶的特异型会被降低,
只有部分正常识别位置被识别
,
此称为
第二活性。

限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物
DNA
的特异性可能降低。即可以把与原来识
别的特定的
DNA
序列不同的碱基序列切断，这个现象叫
Star
活性。

Star
活性出现的频率，根据酶、
底物
DNA
、
反应条件的不同而不同，
几乎所有的限制酶
都具有
Star
活性。 并且，它们除了识别序列的

范围增大之外，
还发现了在
DNA
的一 条链上加入切口的单链切口活性，
所以为了极力抑制
Star
活性，一般情况下，即使 会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性
pH
、高盐浓度条
件下进行反应。< br>

每个限制性内切酶都有对应的甲基化酶
(methylase)，由于一些特定位点被甲基化酶甲
基化
,
使得限制性内切酶无法切割
DN A
链（甲基化敏感）。

基因工程（
genetic engineerin g
）
，也叫基因操作、遗传工程，或重组体
DNA
技术。它是
根据人 们预先设想，
采用酶学的方法，将目的基因
（所需要的基因）重组到一个适宜的载体
上 组成重组子，
再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，
以达到改造生物细胞的目
的的技术。

设计限制性核酸内切酶反应

? 根据待酶切
DNA
的量确定酶量和反应体积。

? 根据酶的活性程度确定基本缓冲体系。

? 限制性核酸内切酶对盐度敏感，控制盐度。

? 反应时尽可能做到无菌。

? 考虑限制性核酸内切酶的第二活性
(
星号活性
)(Star Activity)
。

相同粘性末端连接


如果外源
DNA
和载体
DNA
均用相同的限制性内切酶切割，则 两种
DNA
分子均含有相同的
末端，因此混合后它们能顺利连接为一个重组
D NA
分子。


用两种同尾酶分别切割外源
DNA
片段和载体
DNA
，由

于产生的粘性未端相同，因此也可方便地连接。

酶切位点的定点更换


在有些分子克隆实验中，需要将
DNA
上的一种限制性内切酶识别序 列转化成另一种酶的
识别序列，以便
DNA
分子的重组
.
有两种方法可以达到这个目的。

1
．加装人工接头。接头是一段含有某种限 制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，
通常是八聚体和十聚体。

2
．改造识别序列。这种方法的原理是利用一种限制性内切酶的识别序列改造另一种酶的识
别序列，从而使 前者迁移到后者的位置上。

1
、一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么（比如双酶切）？


其步骤如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种
缓冲液中都 要有活力，即：使用通用缓冲液。

谷氨酸钾缓冲液适用所有的酶切。

2
、能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？


可以，< br>一般而言，
甘油浓度超过
8%
对酶切有抑制。
有些酶在高的甘油浓度中 会产生星号
活力。限制性内切酶提供在
50%
的甘油中，故
10 ul
反应体积中不应加入超过
1.6 ul
的酶。

限制酶酶切图谱
(Restriction Mapping)
是不同的限制性内切酶相对位置的物理图谱。


- 5 -

应用一系列限制性内切酶把待分析的双链
DNA
切割成大小不 同的片段。
由凝胶电泳
(Gel
Electrophoresis)
分离限 制片段并测量大小。通过分析比较就可以推断出在
DNA
分子上限制
酶切的位置。
限制性片段长度多态性

在
DNA
顺序中，如果某个碱基发生 了突变，使突变所在部分的
DNA
序列产生
(
或缺失
)
某< br>种限制性内切酶的位点。当利用该限制性内切酶消化此
DNA
时，会产生与正常不同的限 制性
片段。
这样，
在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，
即
限制性片段多
态性（
Restriction Fragment Length Polymorphism
，
RFLP
）
。


第
4
章载体


用于基因克隆的载体

质粒（
plasmid
）

噬菌体或病毒
DNA
考斯质粒（
cosmid
）与噬菌粒

人造染色体载体


载体的功能

1.
运送外源基因高效转入受体细胞

2.
为外源基因提供复制能力或整合能力

3.
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

载体应具备的条件

1.
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

2.
具有合适的筛选标记

3.
具有较高的外源
DNA
的载装能力

4.
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

5.
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

载体的种类

按来源分：
质粒载体
(plasmid
vector)
、
噬菌体载体
(phage
vector)
、
柯氏质粒载体
(cosmid
vector)
、病毒载体
(virus vector ).

按作用分：
克隆载体
(cloning
vector
)
、
表达载体
(expression
vector)
、
穿梭载体
(shuttle
vector)


质粒

质粒是生物细胞内固有的、能独 立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸
分子。

质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是
DNA
型的

绝大多 数的天然
DNA
质粒具有共价、封闭、
环状的分子结构，即
cccDNA。
质粒
DNA
的分子
量范围：
1 - 300 kb
质粒的基本特征

1.
质粒的自主复制性

质粒能利用寄主细胞的
DNA
复制系统进行自主复制

质粒
DNA
上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系

根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：

严紧型复制控
制的质粒
1 - 3
拷贝
stringent plasmid
松弛型复制控制的质粒
10 - 60
拷贝
stringent plasmid

- 6 -