基因工程基础知识

2021年2月28日发(作者：冷光牙齿美白)

第一章

基因工程

第一节

基因工程概述

一．基因工程的概念

操作环境

生物体外

操作对象

基因

操作水平

分子水平

基本过程

剪切→拼接→导入→表达

结果

人类需要的基因产物

由于基因工程是在
DNA分子
水平上进行操作
,
因此又叫做
重组
DNA
技术。

二．基因工程的基本工具

（一）
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
（简称
限制酶
）

1
．来源：主要是从
原核生物
中分离纯化出来的。

2．功能：能够识别双链
DNA
分子的某种
特定
的核苷酸序列，并且使每一 条链中
特定
部位的两

个核苷酸之间的
磷酸二酯键
断开。

3
．结果：经限制酶切 割产生的
DNA
片段末端通常有两种形式：
黏性末端
和
平末端
。


（二）
“分子针线”——
DNA
连接酶

1
．分类：根据酶的来源不同，可分为
E
·
coliDNA
连接酶和
T
4
DNA
连接酶两类

2
．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键
。

★两种
DNA
连接酶
(E
·
coliDNA
连接酶 和
T
4
DNA
连接酶
)
的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键

②区别：
E
．
coIiDN A
连接酶来源于大肠杆菌，只能使
黏性末端
之间连接；

T
4
DNA
连接酶能缝合
两种末端
，但连接平末端之间的效率较
低。

★
DNA
连接酶与
DNA
聚合酶作用的比较


不同点


连接的
DNA
模板

连接的对象

相同点

作用实质

化学本质

(
三
)

“分子运输车”——
载体

1.
载体具备的条件：

①能在受体细胞中
复制
并
稳定保存
；

②具有一至多个
限制酶切割位点
，供外源
DNA
片段插入；

③具有
标记基因
，供重组
DNA
的鉴定和选择。

2.
基因工程常用的载体有：

质粒

、

噬菌体

和

动、植物病毒

等。

最早应用的载体是
质粒
，它是细菌细胞中的一种很小的双链
环状
DN A
分子。

三．基因工程的基本过程


1
DNA
连接酶

双
链

不要
模板

2
个
DNA
片段

DNA
聚合酶

单
链

要
模板

单个脱氧核苷酸加到已存在的单链
DNA
片段上

形成
磷酸二酯键

蛋白质


(
一
)
获得目的基因（目的基因的获取）

1.
获取方法 主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。

②用人工的方法合成。

★获得原核细胞的目的基因可采取
直接分离
，获取真核细胞的目的基因一般是
人工合成
。

★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

2.
利用
PCR
技术扩增目的基因

（
1
）
PCR
的含义：是一项在生物体外复制特定
DNA
片段的核酸合成技术。< br>
（
2
）目的：获取大量的目的基因

（
3
）原理：
DNA
双链复制

（
4）过程：第一步：加热至
90
～
95
℃
DNA
解链为单 链
；

第二步：冷却到
55
～
60
℃，
引 物与两条单链
DNA
结合
；

第三步：加热至
70
～
75
℃，
热稳定
DNA
聚合酶从引物起始进行互补链的合成
。

（
5
）特点：指数形式扩增

(
二
)
制备重组
DNA
分子（基因表达载体的构建）

1
．重组
DNA
分子的组成：除了目的基因外，还必须有
标记基因
。

★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有
目的基因
，从而将
含有目的基因的细胞
筛选出
来。

2
．方法：
同种
限制酶分别切割载体 和目的基因，再用
DNA
连接酶
把两者连接。

(
三
)

转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）
1.
转化的概念：是
目的基因
进入受体细胞内，并且在受体细胞内
维持稳 定
和
表达
的过程。

2.
常用的转化方法：
①
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是
农杆菌
介导转化技术（
农 杆菌
转化法）
，其次
还有
基因枪
介导转化技术（
基因枪法）和
花粉管通道
技术（
花粉
管通道
法）
。

②
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是
显微注射
技术。此方法的受体细 胞多是
受精卵
。

③
将目的基因导入微生物细胞：
Ca
处理
法。

(
四
)
筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表 达（目的基因的检测
与鉴定）

1.
首先要检测转基因生物的染色体
DNA
上是否
插入了目的基因
，方法是采用
DNA
分子杂交
技
术。

2.
其次还要检测目的基因是否
转录出
mRNA< br>，方法是采用
DNA
分子杂交
技术。

3.
最后检测 目的基因是否
翻译成蛋白质
，方法是采用
抗原—抗体杂交
技术。

4.
有时还需进行
个体生物学水平
的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。

第二节

基因工程的应用

1
．
运用基因工程改 良动植物品种最突出的优点是：
能打破常规育种难以突破的
物种之间的界限
。

2
．基因工程的应用


2
＋

（1
）植物基因工程：抗
虫
、抗
病
、抗
逆
转基因 植物，利用转基因改良植物的品质。

（
2
）动物基因工程：提高动物生长速 度来提高产品
产量
、改善产品
品质
，用转基因动物生产
药
物
，用转基因动物作器官移植的
供体
等。

（
3
）基因诊断和基因治疗：

基因诊断：
又称为
DNA
诊断，
是采用
基因检测
的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带< br>病原体。

基因治疗：指利用
正常基因
置换或弥补缺陷基因的治疗方法。

实例：
ADA
基因缺陷症的基因治疗

第三节

蛋白质工程

1
．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的
结构与功能之间的关系，通过
改造基因
，以定向改造天然
蛋白质，甚至创造自然界不存在的、 具有优良特性的蛋白质。

2
．蛋白质工程的基本原理

预期蛋白质 功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的
氨基酸
序列→找到对应的
脱氧核
苷酸
序列（基因）→具有预期功能的蛋白质

3.
蛋白质工程的应用

（
1
）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。

（
2
）合成嵌合抗体。
（
3
）改变蛋白质的活性。

★蛋白质工程与基因工程区别


实质

结果

联系



















蛋白质工程

通过
改造基因
，以定向改造天然蛋白
合成自然 界
不存在
的蛋白质

基因工程

将
目的基因
从供体转移到受体细胞，并在
只能生产自然界
已存在
的蛋白质

质，甚至创造自然界不存在的蛋白质

受体细胞中表达

蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的
第二代
基因工程

3