基因诊断

2021年2月28日发(作者：铁树叶的功效与作用)
第九章


基因诊断





基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。

基因诊断的主要技术：

1
、核酸分子杂交

2
、聚合酶链反应（
PCR
）

3
、基因芯片技术


第一节

核酸分子杂交技术


核酸杂交（
Nucleic
acid
hybridization
）是指具有一定同源性的两条单链核酸
在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。


一、核酸杂交的基本原理

DNA
的变性和复性
：

在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，
DNA
的双链可解开
成为单链 ，这一过程称为
DNA
的变性（
Denaturatioin
）
。高 温、低盐和有机溶剂
促进
DNA
变性。

Tm
值是反映DNA
的热稳定性的一个参数，称为
DNA
的熔化温度，系指一
半的双链
DNA
解离成为单链时的温度。

DNA
的热稳定性或
Tm
值直接与其碱基组成特别是
GC
碱基对含量有关，
GC
碱基对含量越 高，
Tm
值也越高。

DNA
的杂交即复性
（
Re naturation
）
是变性的单链
DNA
在一定的条件下
（低< br>于
Tm
的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与
Tm
值相关。

影响杂交的主要因素
：

温度：一般在低于
Tm
约
15
至２５度的温度下杂交速率最快。

盐浓度：
钠离子 增加杂交分子的稳定性，
降低钠离子浓度强烈地影响
Tm
值
和复性速率。但当 钠离子浓度超过
0.4M
时，对复性速度和
Tm
值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加
1%
的甲酰胺，
DN A/DNA
或
DNA/RNA
双链的
Tm
值减少
0.72< br>℃。常用
50%
甲酰胺

硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。

二、核酸探针的选择和标记

核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已 知核酸片段，
它必
须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。

（一）核酸探针的类型

1
、克隆的
DNA
片段，常用
cDNA
探针。

2
、
RNA
探针（
Riboprobe
）


RNA
探针的优点是特异性高；
杂交效率
(
灵敏度
)
更高。
适合于
Northen
杂交、
原位杂交等。主要缺点是不 稳定，易被降解，另外其制备较困难。

3
、寡核苷酸探针

可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。

4
、聚合酶链反应扩增产物

是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。

（二）核酸标记的类型


放射性同位素

目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或
低丰度
mRNA
检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。


核酸探针标记常用的同位素有以下几种：

１、

３２< br>P
：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（
14.3
天）
，放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。

２、

35
S
：放射性较低，半衰期长（
87.1
天）
，灵敏度 较高；低散射，因此在
用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等
实 验。

３、

33
P
：是一种较理想的同位素，它的放射 性较低，灵敏度高，分辩率好，
半衰期也较长
(25.4
天
)
，适用 范围较广。但价格偏高。

非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。

优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。

（三）核酸探针的标记

1
、随机引物法（
Random priming
）

随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的 混合物，
因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。

标记酶：大肠杆 菌
DNA
聚合酶Ⅰ的大片段－
klenow
片段。

特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。

2
、缺刻平移法
(Nick translation0

标记酶 ：大肠杆菌
DNase
Ⅰ（极微量）和
DNA
聚合酶Ⅰ。

用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。

3
、
RNA
探针的制备和标记


RNA
探针可用
RNA
聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物
大小均一，有 较高的比活，特异适合于
Northern
杂交和原位杂交。

4
、聚合酶链反应标记
DNA
探针

利用
Taq DNA
聚合酶和标记的
dNTP,sk
以少量的起始模板合成高比活的
c
双链或单链
DNA
探针。

5
、寡核苷酸探针的标记

5’
-
端标记：
T4< br>多核苷酸激酶标记法，
一般用于制备
DNA
序列分析时用的
5’
-
标记的寡苷酸引物。

3’
-
端标记：末端转移酶法，
32
P-dNTP
或
ddNTP
。

6
、非同位素 核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位
素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶 标记法直接对
5’
-
端进行非同位素标记。


三、常用核酸杂交技术

滤膜杂交

固相杂交







核酸杂交

原位杂交

液相杂交


滤膜杂交是指先将待检测的核酸序 列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，
然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。

滤膜杂交的基本过程为：

1
、核酸探针的制备和标记；

2
、核酸片段的凝胶电泳分离；

3
、将凝胶中的核酸片段通过印迹 （
blot
）转移到某种固相支持物上；

4
、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交（通过还包括预杂交）
；

5
、洗膜（除去未杂交的游离探针等）
；

6
、检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）
。

（一）斑点／狭缝印迹
（
Dot/slot blot
）
杂交：DNA
或
RNA
样品经变性后直接点
样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测 。其优点是简单、迅速，可同时做多
个样品；缺点是特异性不好，有一定比例的假阳性，此外，靶核酸的 分子
大小难于判断。

（二）
Southern
印迹：指将经过电泳 分离的
DNA
片断转移到一定的固相支持物
的过程。

Southern
印迹杂交的步骤如下：

1
、用限制性内切酶消化大分子
DNA;
2
、用琼脂糖凝胶电泳对
DNAa
片段按分子量大小分离；

3
、
将
DNA
片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，
再转移到适 当的固相支
持物上并与之结合；

４、

探针与膜上的
５、

检测。

DNA
杂交；

Southern
印迹杂交主要用于基因组结构分析 、基因组
DNA
的定性和定量分
析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等 。

（三）
Northern
印迹：
是指
RNA
经 变性凝胶电泳后，
将其转移到固相支持物上，
以便用杂交反应检测特定的
mRNA分子的含量与大小。是基因表达研究
分析的标准方法。

Nothern
印迹的基本过程包括：

1
、
RNA
的提取；

2
、
RNA
变性电泳；

3
、
RNA
转移和固定；

4
、杂交；

5
、检测。

除
RNA
的提取和变性胶电泳与
DN A
不同外，其余基本与
Southern
印迹相
同，关键是减少实验中的RNA
酶污染。

（四）核酸杂交在基因诊断中的应用

通过核 酸杂交技术，可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针，去
检测未知核酸序列。因此，核酸杂交可 用于基因鉴定和基因突变分析等领域。

1
、限制性片段长度多态性（
RFLP
）分析



多态性（
polymorphism
）指基因组中特定基因座位（
DNA序列）存在两种或
两种以上状态（等位基因）
，并且其中任何一个等位基因在人群中的频率 不低于
1%
。

限制性片段长度多态性
（
RFLP
）
是由于
DNA
变异
（产生新的酶切位点或消
除原有的酶切位点）< br>导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。
可借
助
southern blotting
或
PCR
的方法进行检测

RFLP
分析与遗传病基因诊断。

人类染色体
VNTR
序列的
RFLP
分析图谱：
DNA fingerprinting
。

2
、等位基因特异性寡核苷酸（
ASO
）探针杂交

寡核苷 酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，
因此可用人工合成的
针对正常和突变等位基因的 特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。

3
、基因表达分析




第二节

聚合酶链反应（
PCR
）技术


一、
PCR
的基本原理

（一）
PCR
的基本过程


PCR
是一种体外扩 增特异
DNA
片段的技术。它包括下列三个基本步骤：

常用
Northern blotting
或原位杂交分析。

1< br>、变性（
Denaturation
）
：待扩增的
DNA
模板 加热变性成单链；

2
、退火（
Annealing
）
：降 低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；

3
、延伸（
Extensio n
）
：在适当条件下，利用
DNA
聚合酶使引物延伸，产生新的
双链 。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。

PCR
产 物是介于引物的
5’
端之间的双链
DNA
片段。

（二）
PCR
体系中的主要成份

1
、
Taq DNA
聚合酶

是一种耐热的
DNA
聚合酶，具有
5’< br>-3
’
DNA
聚合酶活性，
一般有
5’
-3
外切酶活性，有或无
3’
-
5’
外切酶活性（校对活性）
，无校对活 性的酶
在
PCR
中错掺率较高。

PCR
中
Taq
酶的用量一般为
0.5-2.5U
，
过多易造成非特异性扩增，过少可能
灵敏度不够。

2
、寡核苷酸引物

是决定
PCR
扩增特异性的关键。


设计
PCR
引物时的几条原则：

①

引物长度一般
15-30
碱基，过短则特异性低；

②

避免内部二级结构；

③
G/C
和
A/T
碱基均 匀分布，
G/C
含量在
45%-55%
之间；

④

两个引物（特别是
3’端）间不能发生互补，以免形成引物引物二聚体；

⑤

引物的
3’
-
端碱基一般应与模板严格配对，
并且
3’端为
G
、
C
或
T
时引发效
率较高 ；

⑥

引物的
5’
-
端可添加与模板无关的序列 （如限制性内切酶的识别位点、
ATG
起始密码子或启动子序列等）

PCR
中所用引物浓度一般在
0.1-0.5uM
太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。

3
、
MgCl2 Mg2+
浓度除影 响
Taq
酶活性外，还影响双链
DNA
的
Tm
值，因而影响
PCR
的特异性和扩增效率。


PCR
中的最适
MgCl2
浓度一般为
1.5-2.5mM(
注意游离
Mg2+
浓度 还与能结合
Mg2+
的化合物如
dNTP
、
EDTA
等的浓度有关。

4
、脱氧核苷三磷酸（
dNTP
）一般采 用均衡的
dNTP
浓度，
4
种
dNTP
各为
< br>200umol/L,dNTP
可减少游离
Mg2+
，因此影响聚合酶活性和引 物退火。

5
、模板

单、双链
DNA
，以及
RNA
经逆转录合成的
cDNA
。


PCR样品可以是粗制品，但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰
Taq
酶活性
的抑制剂

。





引物
/
模板的比率影响
PCR
的特异性。