直接接种无菌检查法验证方案及报告

2021年2月27日发(作者：乐山市人民医院)

贵州金玖生物有限责任公司

验证方案及报告






验证方案名称：直接接种无菌检查方法验证








验证方案编号：
































验证完成日期：

































有



效



期：































验证方案申请人
:














日期
:




年



月



验证方案审核人
:














日期
:




年



月



验证方案审批人
:














日期
:




年



月


















日


日


日




1
概述

无菌检查法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的检查法，

是
作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。
它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性

，

液体培 养基变浑浊一般表明
样品受微生物的污染。
基于微生物污染的不均匀性，
使无菌检查法 结果的可信度受许多因素
制约，

如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量 、操作环境、无菌技术等。检
验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、
方法、手段的科学性、
准确性的重要
组成部分

，是保证检验结果的公正、

科学、准确的基础

。



2
验证目的




< br>对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本
公司产品的无 菌检查。

3
实验原理




直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作
用，从而消除抑 菌作用对无菌检查的影响。





本实验通过设计对照 试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得
出直接接种法无菌检验的有效性。

4
验证范围

实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。

5
执行程序

文件编码

WI-Q-22
WI-Q-19
WI-Q-23
WI-Q-21
WI-Q-34

6
职责






文件名称

无菌检查操作规程

无菌试验用品清洁灭菌及保管操
规程

培养基配制操作规程

微生物限度检查操作程序

无菌检查用品清洁灭菌及保管操
作规程

存放部门

办公室

办公室

办公室

办公室

办公室

姓名






7
验证内容


职务

总经理

职责

负责验证方案的批准实施、验证报告的批准

质检部经理

负责验证方案、验证报告的审核并组织实施

生产部经理

QA
检验员

负责验证方案、验证报告的审核并组织实施，负责验证
过程中本车间人员的安排

负责验证方案、验证报告的起草，并负责验证过程中现
场的监控及取样

负责按制订无菌检验规程实施检验和验证实验

1




建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养
24~72< br>小时，比
较观察菌落的生长状况，得出结论。

8
验证指示物

本实验所用菌种为购于贵州食品药品监督管理局标准菌株
:大肠埃希菌、金黄色葡萄球
菌、白色念球菌及生孢梭菌。

9
实验过程



（
1
）培养基的配制






用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基






用于白色念球菌的改良马丁培养基






用于生孢梭菌的流体硫乙醇酸盐培养基




（
2
）供试品的制备






术泰舒
TM
生物多糖冲洗胶液供试品：直接取成品
10ml
，加pH7.0
氯化钠—蛋白胨缓
冲液至
100ml
，混匀，作为供试品。< br>





速凌
TM
止血纱供试 品：
将包装好的止血纱打开，
用剪刀将止血纱剪碎，
放入
100mlpH7. 0
氯化钠—蛋白胨缓冲液中浸泡
1
小时，取水层作为供试品。

（
3
）供试菌液的制备

大肠埃希菌菌液：
取经
3 2.5
℃培养
19
小时的大肠埃希菌培养物
1ml
，加
9m l
生理盐
水，
10
倍稀释至约
10
-5
~10-8
之间
,
混匀备用。









金黄色葡萄球菌菌液：
取经
32.5℃培养
19h
小时的金黄色葡萄球菌培养物
1ml
，
加
9ml
生理盐水，
10
倍稀释至约
10
-5
~10
-8
之间
,
混匀备用。





白色念球菌菌液：取经
25.5
℃培养
72
小时的白色念珠菌真菌斜面培养 物，加入生
理盐水
4ml
洗下孢子，
吸出转移至空试管作为原液，
取
1ml
加
9ml
生理盐水，
10
倍稀释至
10-6
，取
1.2ml
加生理盐水
9ml
，混匀备用。





生孢梭菌菌液：取经
36
℃培养
18h
的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物
1ml
，
加
9ml< br>生理盐水，
10
倍稀释至
10
-6
，混匀备用
。



（
3
）实验设计

实验样品 组：按照本公司常规微生物检验方法进行，加入抑菌中和剂，最后接入已知
量的菌株（≤
100 cfu
）
，培养观察。

阳性对照组：
以
0.1%
的蛋白胨代替供试品，
加入抑菌中和剂，最后接入同样量的菌株，
培养观察。

阴性对照组：取与实验样品组等量的供试品，加入与中和剂等量的生理盐水，最后接
入已知量的菌株（ ≤
100cfu
）
，培养观察

菌种活性检查组：直接将菌种接种到培养基上，培养观察。

10
标准与判断




1.
如果实验样品组与阳性对 照组的微生物计数相似，表明所用中和剂（中和剂类别及用
量）具有足够的中和效力；




2.
如果阳性对照组与菌种活性检查组的微生物生长数量相似 ，表明所用的中和剂不影响
微生物的生长。




3.< br>阴性对照组微生物生长量应低于实验组，才能证明供试剂有抑菌性，否则该实验无意
义。

3.
样品组的平均菌检计数结果不得低于对照组的
70%
，否则直接否定无菌 检验方法。

11
检验与记录


2

无菌检查验证实验数据表（菌落数
/
皿）

NO:
















供试品：
























实验时间：






试验组名





检验菌种










大肠埃希
菌

1
2
3
4
5
平均




金黄色葡
萄球菌

1
2
3
4
5
平均



白色念球
菌

1
2
3
4
5
平均




生孢梭菌

1
2
3
4
5
平均

实验样品组

























阳性对照组

























阴性对照组

























活性检查组

























结论：
























































实验人：



























日


期：



年



月



日
























复核人：
























































































日


期：



年



月



日



3
12
编写验证报告

（
1
）根据验证方案设计实验；


（
2
）统计实验数据编写验证报告。

13
再验证周期及日常监测



（
1
）无菌检查按所生产的每批次进行日常监测；



（
2
）当无菌检查日常监测出现不符合标准时，必须进行再验证；




（
3
）当无菌检查方法发生改变和生产工艺发生改变时，必须重新验证；



（
4
）本验证方案有效期为
1
年。

14
验证结果与评价



实验人对验证实验结果做好相关记录并进行科学性评价；

15
验证方案的批准



验证小组审阅所有结果及评价分析意见，同意验证结果，签字并按此结论实施。
4








直接接种无菌检查法验证报告

一

实验目的




对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于 本
公司产品的无菌检查。

二

实验原理





直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂 ，消除抑菌作
用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。





本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得
出直接接种法无菌检验的有效性。

三

实验步骤

1.
培养基的配制



大肠埃希菌、
金黄色葡萄 球菌用的营养琼脂培养基：
准确称取营养琼脂培养基
16.5g
，
加入
500ml
纯化水，缓慢加热使其完全溶解。



白色念球菌用 的改良马丁培养基：准确称取改良马丁培养基
14.5g
，加入
500ml
纯 化
水，在加入
6g
琼脂粉，加热使其溶解。



生孢梭菌用的流体硫乙醇酸盐培养基：准确称取流体硫乙醇酸盐培养基
14.5g
，加入
500ml
纯化水，在加入
6g
琼脂粉，加热使其溶解。

2 < br>将上述配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中
11
5
℃，
30min< br>。

2
供试品的制备










术泰舒
TM
生物多糖冲洗胶液 供试品：直接取成品
10ml
，加
pH7.0
氯化钠—蛋白
胨缓冲液 至
100ml
，混匀，作为供试品。










速凌
TM
止血纱供试品：将包 装好的止血纱打开，用剪刀将止血纱剪碎，放入
100mlpH7.0
氯化钠—蛋白胨缓冲液中 浸泡
1
小时，取浸泡液作为供试品。





3
供试菌液的制备：







大肠埃希菌菌液：
取经
32.5
℃培养
19
小时 的大肠埃希菌培养物
1ml
，
加
9ml
生理盐水，
10倍稀释至约
10
-5
~10
-8
之间
,
混匀备 用。









金黄色葡萄球菌菌液：
取经
32.5
℃培养
19h
小时的金黄色葡 萄球菌培养物
1ml
，
加
9ml
生理盐水，
10
倍 稀释至约
10
-5
~10
-8
之间
,
混匀备用。< br>




白色念球菌菌液：取经
25.5
℃培养
72
小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生
理盐水
4ml
洗下孢子，
吸出转移至空试管作为原液，
取
1ml
加
9ml
生理盐水，
-6
10
倍稀释至
10
，取
1.2ml
加生理盐水
9ml
，混匀备用。





生孢梭菌菌液：取经
36
℃培养
18h
的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培 养物
1ml
，
加
9ml
生理盐水，
10
倍稀释至< br>10
-6
，混匀备用
。

4
分别取上述两种供试品
100ml
，加入抑菌中和剂，接入≤
100cfu
菌株（大肠埃希菌、金黄
色葡萄球菌、白色念球菌及生孢梭菌分别进行实验）
，再接种到每种菌株所需的上述培养
基中，作为实验样品组。

5
用
0.1%
的蛋白胨溶液代替供试 品进行同上步骤操作，作为实验阳性对照组。

6
取与实验样品组等量的供试品，加入 与中和剂等量的生理盐水，再同第
4
步操作，作为阴
性对照组。

7
取
100ml
0.1%
蛋白胨溶液，不加中和剂直接接种等量菌株，再接种 到培养基上，作为菌
种活性检查组。

8
将接种好的培养皿放入恒温培养箱 中，
大肠埃希菌、
金黄色葡萄球菌及生孢梭菌培养温度

5
为
23
℃，白色念球菌培养温度为
25
℃，培养数天后，观察并记录菌落 数。

四

实验结果记录

无菌检查验证实验数据表（菌落数
/
皿）

NO:1











供试品：生物多糖冲洗液
















实验时间：






试验组名





检验菌种










大肠埃希
菌

1
2
3
4
5
平均




金黄色葡
萄球菌

1
2
3
4
5
平均



白色念球
菌

1
2
3
4
5
平均




生孢梭菌

1
2
3
4
5
平均

实验样品组

























阳性对照组

























阴性对照组

























活性检查组

























结论：























































实验人：



























日


期：



年



月



日
























复核人：



















































6