手足口病预防控制指南(2009版)附件1 手足口病标本采集及检测技术方案

2021年2月27日发(作者：肝火旺睡不着怎么办)
附件
1


手足口病标本采集及检测技术方案




一、采集标本的种类、保存和运输


（一）粪便标本。


采集病人发病

3
日内的 粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量
5-8g/
份，采集后立
即放入无菌采便管 内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，
4
℃暂存

12
小时内送 达实验室，
-20
℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于
-70
℃冰箱 。


（二）咽拭子标本。


采集病人发病

3
日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽
后壁和两侧 扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有

3-5ml
保存液（含

5%
牛血
清维持液或生理盐水，
推荐使用维持 液）
的
15ml
外螺旋盖采样管中，
在靠近顶端处折断棉签
杆，旋紧 管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4
℃暂存并在

12
小时
内送达实验室，
-20
℃以下低温冷冻保藏，需长期保存 的标本存于
-70
℃冰箱。


（三）血清标本。


各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集

EV71
和

CV
A16
感染的手足口病患儿
的双份血清。采集急性期（发病
< br>0-7d
）和恢复期（发病
14-30d
）双份配对血清用于阐明和分
析
EV71
和
CV
A16
感染后
IgG
和
IgM
抗体的动态变化，
评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特
异性。静脉采集
3-5ml
全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到
2ml
外螺 旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于
-20
℃以下冰箱中冷冻保存。


（四）疱疹液。


在手足口病的实验室 诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采
集多个疱疹作为一份标本。先用

75%
的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱
疹挑破用棉签蘸取疱 疹液，迅速将棉签放入内装有

3-5ml
保存液（含
5%
牛血清维 持液或生
理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本

4
℃暂存立即（
12h
内）送达实验室，－
20
℃以下低 温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－
70
℃冰箱。


（五）肛拭子标本。


采集病人发病

3
日内的 肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻
插入，适度用弧型左右擦拭数下，拔出后
,
迅速将棉签放入装有
3
－
5ml
保存液（含
5%
牛血清
细胞维持液）
的
15ml
外螺旋的采样管中，
采样管 外表贴上带有唯一识别号码的标签。
在靠近
顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。


（六）尸检标本。


采集脑、肺和肠淋巴结等重要组 织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种
组织应多部位取材，每部位应取
2-3< br>份约

5-10g
的组织，淋巴结

2
个，分别置于

15ml-50ml
无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。


（七）脑脊液标本。


出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行 病毒分离或核酸检测。采集时间为
出现神经系统症状后

3
天内，采集量为
1.0-2.0ml
。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，
4
℃暂存立即
(12h
内
)
送达实验室，－
20
℃以下低温冷冻保藏， 需长期保存的标本存于－
70
℃
冰箱。但

EV71
感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到
EV71
病原。

临床标本 在运输和
贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，
12
小时内送达实验
室。依照《人间传染的病原微生物名录》
，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本 按
B
类包装，
置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运 输方式，但在运输
过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级

CDC
实验
室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的 《手足口病病例临床
标本采样登记表》
。


二、标本采集注意事项


在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中 分离到病毒即可诊断该病毒为病因。
用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，
如含5%
牛血清维持液。
用于分子生物学诊
断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一 样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本
应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标 本应冷冻保存。对于血清学诊断，
急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标 本保存液的配置见下
表：


保存液

Eagle`s
液
(MEM)
3%L-
谷氨酰胺

200mM
胎牛血清

7.5%NaHCO3
溶液

青、链霉素


（各

10000U/ml
）

三、实验室检测操作流程


（一）病毒分离。


1.
试剂配置


（
1
）细胞的生长液、维持液的配制见下表：





Eagle`s
液
(MEM)
3%L-
谷氨酰胺
200mM
胎牛血清

7.5%NaHCO3
溶液

青、链霉素

（各
10000U/ml
）


生长液（
GM
）

86.5ml
1.0ml
10.0ml
2.5ml
1.0ml

维持液（
MM
）

92.5ml
1.0ml
2.0ml
3.5ml
1.0ml
80.5ml
1.0ml
5.0ml
3.5ml
10ml



（
2
）粪便标本和肛拭子的处理液


完全

PBS
液中加入

P
．
S
溶液，
终浓度为青霉素

100
单位
/ml
，
链霉素为
100
μ

g/ ml
。

完全

PBS
液的配置：
取以下

1
份

B
液和

1
份

C
液加到

8
份

A
液中即为完全
PBS
工作
液。


A
液：


试剂品名


NACL
加入量


8.00g
KCL
Na2HPO4(
无水
)
KH2PO4
0.20g
0.91g
0.12g
用
600
～
800ml
蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至

1000ml
，

10psi
（
70Kpa
）

15
分钟
高压灭菌，即为不完全

PBS
工作液（不含钙、镁离子）
。


B
液：


试剂品名

MgCl2.6H2O
加入量

0.10g

溶解于
100ml
蒸馏水 中，
10psi
（
70Kpa
）
15
分钟高压灭菌。


C
液：





试剂品名

CaCl2
加入量

0.10g

溶解于
100ml
蒸馏水中，
10psi
（
70Kpa）
15
分钟高压灭菌。


2
．病毒分离细胞系


许多细胞系可支持人肠道病毒（如
EV71
、
CV
A16
）生长。

对于检测手足口病的病原来
说，建议所有怀疑含

EV71
、
CV
A16
等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：


?


RD
细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。


?

HEp
-2
细胞，来源于人喉癌上皮细胞。


3
．标本的处理


（
1
）粪便标本和肛拭子的处理


操作步骤：


1
）在离心管上标记标本号；


2
）每管中加入

10ml PBS
、
1g
玻璃珠、
1ml
氯仿；


3
）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约

2g
加入标记好的离 心管中（确保离心管上
的标号与原始标本的标号一致）
；

肛拭子为

2ml
；


4
）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－
20
℃；


5
）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡

20min
；


6
）
在确保离心机的盖子盖好和 离心桶密封的情况下，
用冷冻离心机在
1500g
条件下离心

20min
；


7
）
在生物安全柜中将每

1
份标本的上清液分别吸入

2
个有外螺旋盖的冻存管中
（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理
1
次）
；


8
）

1
管粪便悬液冻存于－
20
℃作为备份，另

1
管存于

4-8
℃以备接种。


（
2
）疱疹液标本的处理


疱疹液标本通常直接用于

RNA
提取或病毒分离。


（
3
）脑脊液标本的处理


脑脊液标本通常直接用于病毒分离。


（
4
）咽拭子标本的处理


咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少

40
下）
，以 洗下拭子上粘附的病毒及
含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融）
，使细胞破裂，释放病
毒颗粒。
然后在

4
℃条件下，
10000 rpm
离心

20min
，
用上清接种到细胞上或直接提取

RNA
。
如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。


4
．接种和观察（病毒分离）


（
1
）通常使用 ８
ml
的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液
1.5ml
。
显微
镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后

48
小
时左右形成；


（
2
）倒掉生长液（
GM
）
，换上
1-1.2ml
的维持液（
M M
）
；


（
3
）
每一份标本需要同时接种

2
支

RD
细胞和

2
支

HEp-2
细 胞，
正确标记每支细胞
培养管（包括标本的编号、日期、传代数）
；


（
4
）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；


（
5
）每支试管接种
0.2ml
的标本悬液，培养温度要求

36
℃。

（或者使用吸附的方法接
种病毒：
接种标本前，
倒掉生长液
（
GM
）
，
每支试管接种

0.2ml
的标本悬液，
培养温度为

36
℃；
吸附

1
小时后，换上
1.5ml的维持液（
MM
）
。同样每份标本需同时接种

2
支
RD
细胞和

2
支
HEp-2
细胞。

（
6
）
使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，
以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应
（
C PE
）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）
；


（
7
）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录

CP E
（
1+
—
4+
）
、提示细胞
受毒性反应、老化或 污染的影响而发生的变化（
1+
，
<25%;
2+,
25%-50%;
3+,
50%-75%;
4+,
75%-100%
）
；


（
8
）如果有特征性的肠道病毒

CPE
出现，要如实记录 ，并观察直到
75%
的细胞发生变
化（
3+ CPE
）
，然后储藏在－
20
℃以备二次传代；


（
9
）
第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，
待细胞病变稳定出现后－
20
℃或－
70
℃
冻存；


（
10
）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的

CPE 出现，将病毒保存在－
20
℃冰
箱（二代病毒）
。因二代病毒滴度高于一 代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；


（
11
）如果
7 d
之后没有
CPE
出现，那么盲传
1
代继续观察

7d
。
（注意：同一病例标本
的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培 养物应单独传代）
；


（
12
）盲传两代后，仍然没有出现

CPE
的，则判定为阴性；


（
13
）注意：如果接种后

24h
内出现
CPE
，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性
反应。取

100
μ

l
阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐
1h
后用维持液清洗
细胞层，可能会降低毒性反应；



（
14
）几个概念：


A
：
毒性反应：
如果在接种后

1-2d
内细胞 快速凋亡，
这可能是由于标本中含有毒性物质
而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试 管应在
-20
℃冻存，融化后取
0.2ml
接种到
同一类型细胞中（ 此时是第二代）
。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用

PBS
稀
释
10
倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。



B
：
微生物污染：
由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常 使病毒造成的

CPE
无
法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿 或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新
鲜细胞上。


C
：盲传： 有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标
本的试管应在
-20
℃冻存，
融化后取
0.2ml
接种到同一类型的新鲜单层细胞中，
再 观察

7-10d
。
如果盲传两代后仍然没有产生
CPE
， 那么认为这个标本是阴性的。


5
．病毒分离结果解释


RD
细胞支持

HFMD
的主要病原体——
CV
A16
和

EV71
等多种肠道病毒的复制，

CV
A16
和

EV7 1
均能在
RD
细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应
（
CP E
）
，
表现为
细胞圆缩、
分散、
胞浆内颗粒增加，
最后细胞自管壁脱落。
但相同滴度的

CV
A16
和

EV71
在

RD
细胞中生长的速度不同，
EV71
的生长速度要快于

CV
A16
，表现为

EV71
感染

RD
细
胞后出现
CPE
的时间比
CV
A16
早，

EV71
接种细胞后出现
CPE
很快，

但
CV< br>A16
一般要经
过
2
次以上传代才出现明显的
CPE
。

若在使用
RD
细胞分离的同时再增加

HEp-2细胞，可
提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致
HFMD
的病原体，如一些柯 萨奇
B
组病毒）
。但
CV
A16
和
EV71
在
HEp-2
细胞中均不繁殖。


（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。


比较患者急性期血清与恢复 期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方
法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定 抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常
用方法，该方法精确且具有型特异性。

作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中
肠道病毒中和抗体的滴度，
通常用急性期血 清与恢复期血清滴度进行比较，
抗体滴度

4
倍或

4
倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就
要小心 一些。
在中和实验中，
一般要用人肠道病毒参考毒株
（即原型株，
EV71
原型株为

BrCr
株，
CV
A16
原型株为< br>G-10
株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得
到更准确的检测 结果。

使用对肠道病毒敏感的细胞，
如

RD
细胞。用病毒
（血清）
稀释液
（下
面液体配制中的

C 液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定
血清中抗体的滴度，所以要使 用参考病毒（原型株）
，但有时使用所分离到的毒株（临床分离
株）有助于得到更准确的检测结 果，但分离株的滴度（
100 CCID50/0.05ml
）要事先测定。

中
和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现
CPE
， 特异性中和
抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制
CPE
的出现。


1
．液体配制


A
液：血清处理液：
（
100ml
中含下列试剂成份）












MEM





















85ml










3% L-
谷氨酰胺
















1ml










7.5%
碳酸氢钠

















2ml










胎牛血清





















2ml










青、链霉素（各

10000U/ml
）


10ml






B
液：细胞营养液：
（按生长液配方配制，
100ml
中含下列试剂成份）











MEM






















85ml










3% L-
谷氨酰胺
















1ml










7.5%
碳酸氢钠

















2ml










HEPES






















1ml










胎牛血清





















10ml










青、链霉素（各

10000U/ml
）




1ml






C
液：病毒（血清）稀释液：
（按维持液配方配制，
100ml
中含下列液体）











MEM























93ml










3% L-
谷氨酰胺

















1ml










7.5%
碳酸氢钠


















2ml










HEPES






















1ml










胎牛血清





















2ml










青、链霉素（各

10000U/ml
）



1ml

2
．攻击病毒
CCID50
滴定和滴度梯度制备


（
1
）将增殖后的病毒悬液冻融

3
次，然后在
4
℃、
12000rpm
条件下离心

10min
，取上
清液分装于

10
支冻存管中，每管

1.5ml
，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后
废弃；


（
2
）加
Eagle
液
10
倍系列稀释 为
10-1
至
10-8
病毒液，各加入细胞板内，每孔
50
μ

l
，
每稀释度

4
孔细胞；


（
3
）
每孔加细胞悬液
50
μ

l
，
同时设细胞对照
（
50
μ

l
稀释液
+50
μ

l
细胞悬液）
，

36
℃
培养
7d
，观察细胞病变；


（
4
）按
Behrens- K?
rber
公式计算出分离病毒株的
CCID50
；
log CCID50 = L-d (S-0.5)
，
其
中：


L =
实验中使用的最低稀释度的对数值；


d =
稀释梯度的对数值；



S =
终判时阳性部分的总和（即出现

CPE
的细胞孔所占的比例之和）
。


（
5
）
正式试验前应先滴定攻击病毒

2-3
次，
取其平均值，
求出每
0.05ml
中含
100 CCID50
的病毒载量；


（
6
）按照计算好的稀释比 例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即
100
CCID50/0.05ml
）
；


（
7
）取
3
支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的
C
液）

0.9ml
；



（
8
）
用< br>带
滤
芯
的
吸
尖
（
ART
吸
尖
）
吸

0.1ml
已
经
稀
释
好
的
攻
击
病
毒
液
（
即

100CCID50/0.05ml
）到第一支小试管中，换另一支

ART
吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产
生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至

1 CCID50/0.05ml
和
0.1 CCID50/0.05ml
。







3
．稀释血清


（
1
）发病

1-3d
内采取患者急性期血清，发病后

2-4
周采取恢复期血清，分别冻存在
-20
℃备检。


（2
）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液

（上
面液体配制中的

A
液）

0.3ml
，加待测血清
0.1ml
，盖紧塞子，震摇混匀，放

4
℃冰箱过夜，
即为
1
：

4
稀释血清。次日

56
℃、
30min
灭活。


（
3
）打开独立无菌包装

48
孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配
制中的

C
液）
0.3ml
，每份血清使用一排，每排
4
孔。使用移液器吸取处理过的 血清
0.1ml
加入第一孔（即为
1
：
16
）
，吹 吸

8-10
次，吸

0.1ml
加入第二孔（即为

1
：
64
）
，依次至

1
：
1024
，血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行
4
倍倍比稀释，即
1
：
4
、
1
：
16< br>、
1
：
64
、
1
：
256
、
1
：
1024
。


（
4
）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。


4
．病毒中和抗体测定的操作步骤：


（
1
）取一块
96
孔板横向使用，每块板可以做

8
份（
4
对）待测血清，版面设计如下图
所示。
A1-A2
孔（
B1-B2
、
C1-C2
、
D1-D2
、E1-E2
、
F1-F2
、

G1-G2
、

H1-H2
）中每孔加入
1:1024
稀释度的待测血清
0.05m l
，不必更换吸尖，在

A3-A4
孔（
B3-B4
、< br>C3-C4
、
D3-D4
、
E3-E4
、
F3-F4
、
G3-G4
、
H3-H4
）中每孔加入

1:256
稀释度的待测血清

0.05ml
，
A5-A 6
孔
（
B5-B6
、
C5-C6
、
D5-D6、
E5-E6
、
F5-F6
、
G5-G6
、
H 5-H6
）中每孔加入
1:64
稀释度的待测
血清

0.0 5ml
，
A7-A8
孔（
B7-B8
、
C7-C8
、
D7-D8
、
E7-E8
、
F7-F8
、
G17 -G8
、
H7-H8
）中每孔
加入

1:16
稀释度的待测血清
0.05ml
，

A9-A10
孔（
B9-B10
、

C9-C10
、

D9-D10
、

E9-E10
、

F9-F10
、

G9-G10
、
H9-H10
）中每孔加入

1:4
稀释度的待测血清

0.05ml
，
A11-A12
孔