细胞培养 中和试验、TCID50原理 方法

2021年2月27日发(作者：耳鸣保健操)
实验二

传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，
了解不同传代细胞的形态及接 毒后的病变特
征，掌握细胞的传代培养
方法
、病毒接种
方法
及收毒< br>方法
。

二、常用细胞的种类

BHK-21
：仓鼠肾传代细胞

PK-15
：猪肾传代细胞

IBRS-2
：猪肾传代细胞

Hela
：人的子宫瘤细胞

Vero
：非洲绿猴肾细胞

Marc-145
：来源于
Vero
细胞

TK-143
：人的胸苷激酶阴性细胞

Sf9
：昆虫细胞

三、材料

1
、
100ml
细胞瓶、吸管、吸球、
96
孔细胞培养板、加样器、枪头

2
、
BHK-21
（
baby hamster kidney
）细胞

3
、
0.25%
胰酶
4
、生长液：含
10%
犊牛血清、
200U/ml
青、链霉素的
DMEM

维持液：含
2-5%
犊牛血清、
200U/ ml
青、链霉素的
DMEM
5
、伪狂犬病病毒液（
PRV
）

四、传代细胞培养的条件要求

1
）细胞密度：
2-3
×
10
5
个
/ml
2
）
pH
范围

最适
pH7.0-7.4
，耐受
pH6.6-7.8
3
）培养温度


哺乳动物细胞一般为
37
℃


昆虫细胞
28-30
℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1
、
胰酶

使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多 肽链发生水解，
导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（
EDTA
）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3
、灰色链丝菌酶

：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽
酶的混合物。

六、营养液

1
、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2
、血清

1
）血清的种类


胎 牛血清、
新生犊牛血清、
成年牛血清、
马血清、
鸡血清、
兔血清、< br>羊血清、
人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2
）血清的处理

无菌采集，过滤除菌。用前
56
℃灭活
30min
。

3
）血清的作用

A
、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B
、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C
、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

D
、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。

E
、给培养液提供良好的缓冲系统。

F
、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。

4
）应用血清存在的问题

A
、血清中存在不少有害于细胞生长和繁 殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑
制因子。

B
、血清的成分不明确，影响对结果的分析。

C
、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七、传代细胞系培养

1
、优点：
1)
可以无限的传代。

2)
不少细胞系对病毒很敏感。

3)
某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，
适合病毒抗原的大量生
产。

4)
生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

2
、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

3
、培养
方法

1
）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2
）
加入
2ml
胰酶消化液，
于
37
℃ 培养箱放置几分钟，
至细胞间出现空隙或细胞
变圆后，倒去消化液。

3）
加入生长液
,
反复吹打几次，
使细胞分散成单个细胞，
然后分 装于
3
个小瓶中。
再在每个小瓶中补充生长液至
10ml
，然后置< br>37
℃培养箱培养，培养
1-2
天即可
长成单层。

八、病毒（
PRV
）在传代细胞中的培养

1
、选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2
、加入适量的病毒悬液

3
、置温箱中感作（吸附）
45min-1h
。

4
、
取出瓶子，
倒掉或不倒掉培养液，
补足维持液，
置温箱中继续培养，直至
80%
以上的细胞病变。

5
、收毒：将病变的细胞置于< br>-20
℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中
振摇几次，
以使细胞完全 从瓶壁上脱落。
然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器
中。低温贮藏备用。


实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

一、实验目的


了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养
方法
。

二、材料

1
、
9-11
日龄鸡胚

2
、照蛋灯与蛋座

3
、碘酊棉球与酒精棉球

4
、大剪子、眼科剪、小镊子

5
、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、

6
、胰酶、生长液、维持液

三、细胞培养的条件要求

1
）细胞密度

原代细胞：
4-6
×
10
5
个
/ml
传代细胞：
2-3
×
10
5
个
/ml
2
）
pH
范围

最适
pH7.0-7.4
，耐受
pH6.6-7.8
3
）培养温度

哺乳动物细胞一般为
37
℃


昆虫细胞
28-30
℃

四、操作步骤
< br>1
、取
9-12
日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。

2
、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚
颈部， 取出鸡胚放于灭菌平皿中。

3
、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用
DMEM
冲冼
2
次。

4
、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5
、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，
用
DMEM
充分冲洗，
并静
置几分钟，
待组织块下沉，
吸弃上层液体，
再加
DMEM。
如此反复冲洗
2-3
遍。

6
、于沉淀组织块内加入 约
4
倍量的
0.25%
胰酶，并调
pH
至
7.6- 7.8
，振荡混匀
后置
37
℃水浴中感作
30
分钟，
每
10
分钟轻轻摇动一次，
使细胞消化完全
（组
织块变散松，沉降 渐变缓慢时即表示消化足够）。

7
、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用
DMEM
轻洗
2
次后，加入生长
液
5ml
，用大口 径吸管反复吹打，使细胞游离。

8
、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

9
、细胞计数


取细胞悬液
0.5ml+2ml
0.1%
结晶紫—枸椽酸
（
0.1mol/L
）
溶液，室温或
37
℃
温箱中
5-10min
，充分振荡后进行计数。< br>

按白细胞计数法计算
4
角
4
个大方格内的 细胞总数（
N
）。


每
ml
悬液中的细胞 数（
n
）
=N/4
×
10000
×
K
（稀 释倍数）。


活细胞数应在
90%
以上。

10
、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为
4-6
×
106
个
/ml
，分层于
细胞培养瓶中，
每瓶
1ml
，
再补加
DMEM
生长液至
10ml
，
盖上盖子，
置于
37
℃
恒温箱中培养。









○表示可计数

●表示不计数








五、结果的观察


于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，
细 胞呈纤维状。



实验四

病毒感染力的滴定（
TCID
50
的测定）

一、实验目的


了解病毒感染力
测定
的几种常用< br>方法
，掌握半数细胞培养物感染量
TCID
50
的操作步骤、计算方法
及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量
LD
50
( 50% lethal dose)
：用动物或鸡胚来检测

半数鸡胚感染量
EID
50
(egg 50% infective dose)
：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量
TCID
50
（
50% tissue culture infective dose)
：用细胞
来检测

蚀斑形成单位（
plaque forming unit
，
PFU
）：用细胞来检测

三、材料

1
、长满单层的细胞
1
瓶

2
、胰酶、吸球、吸管、生长液

3
、
96
孔细胞培养板

4
、加样器、枪头

5
、病毒液（
PRV
）

四、
TCID
50
的操作步骤

1
、在青霉素瓶或 离心管中将病毒液作连续
10
倍的稀释，从
10
-1
-10
-10
。

2
、将稀释好的病毒接种到
96
孔微量培养板 中，每一稀释度接种一纵排共
8
孔，
每孔接种
100
?
l
。

3
、在每孔加入细胞悬液
100
?
l
，使细胞量达到
2~3
×
10
5
个
/ml
。

4
、设正常细胞对 照，正常细胞对照作两纵排。
（
100
?
l
生长液
+100
?
l
细胞悬液）

5
、逐日观察并记录结果，一般需要观察
5-7
天。

6
、结果的计算，按
Reed- Muench
两氏法或
Karber
法

五、
TCID
50
的计算方法

1
、
Reed-Muench
两氏法

病毒液稀释度

出现
CPE
孔数

无
CPE
孔数

累

计

出现
CPE
孔所
占的
%
CPE
孔数

无
CPE
孔数

10
-1

10
-2

10
-3

10
-4

10
-5

10
-6

8
8
7
3
1
0
0
0
1
5
7
8
27
19
11
4
1
0
0
0
1
6
13
21
100
（
27/27
）

100
（
19/19
）

91.6
（
11/12
）

40
（
4/10
）

0.7
（
1/14
）

0
（
0/21
）

CPE
：
Cytopathic effect
距离比例＝（高于
50%
病变率的百分数
-50%
）
/
（高于
50%
病变率的百分数
-
低于
50%
病变率的百分数）



＝（
91.6-50
）
/
（
91. 6-40
）


＝
0.8
lgTCID< br>50
=
距离比例×稀释度对数之间的差
+
高于
50%
病变率的稀释度的对数

=0.8
×
(-1)+(-3)
=-3.8
TCID
50
=10
-3.8
/0.1ml
含义：将该病 毒稀释
10
3.8
接种
100
?
l
可使
5 0%
的细胞发生病变。

2
、
Karber
法

病毒液稀释度

出现
CPE
的孔数

出现
CPE
孔的比率

10
-1

10
-2

10
-3

10
-4

10
-5

10
-6


lgTCID
50
=L-d(s-0.5)
8
8
7
3
1
0
8/8=1
8/8=1
7/8=0.875
3/8=0.375
1/8=0.125

0/8=0
L
：最高稀释度的对数

D
：稀释度对数之间的差

S
：阳性孔比率总和

lgTCID
50
=-1-1
×
(3.375-0.5)
=-3.875
TCID
50
=10
-3.875
/0.1ml
含义：将该病毒稀释
10
3.875
接种
100
?
l
可使
50%
的细胞发生病变。



实验五

血清中和试验

一、实验目的


了解中和试验的基本原理和几种不同的
测定方法
，
掌握固定病毒—稀释血清< br>法的操作步骤和计算
方法
及含义。

二、原理


抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。

三、用途

1
、疾病诊断

2
、病毒分离株的鉴定

3
、不同病毒株的抗原关系研究

4
、疫苗免疫原性的评价

5
、免疫血清的质量评价

6
、
测定
实验动物血清中是否存在抗体

四、分类

(
一
)
蚀斑（痘斑）减数试验

将病毒—正常血清混合物 以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞
上，
随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，
进行蚀斑
测定
，
比较病毒—正常血清组和
病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两 者的差数表示待检血清的中和能力。

以试验组的蚀斑数比对照组减少
50%
作为判定依据，
血清稀释度就是其蚀斑
减数试验效价。

(
二
)
交叉保护试验

先将实验动物进行主动免疫或被动 免疫，
然后以待检病毒进行攻击，
根据实
验动物被保护的情况，
判定待检V
的种类或型别。
这一
方法
的缺点是试验周期太
长，并且需要大 量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知
V
鉴定未知
V
；
应用 已知免疫血清鉴定未知
V
；应用已知
V
鉴定未知血清。

（三）终点法中和试验

1
、固定病毒—稀释血清法

< br>将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为
100
或
200
个TCID
50
、
EID
50
或
LD
50
）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清
-
病毒混合物接种于敏
感细胞、< br>鸡胚或实验动物，
测定
被检血清阻止组织培养细胞、
鸡胚或实验动物发
生病毒感染的能力及其效价。

以能保护
50%
组织培养细胞、鸡胚或实验动 物不发生病变、感染或死亡的血
清最高稀释倍数，作为该血清的
50%
中和效价（PD
50
）。

2
、固定血清——稀释病毒法

在固定量的血清中，
加入等量不同稀释度的病毒，
用对照非免疫血清
（对照
组）和待检血清同时进行
测定
，计算每一组的
TCID
50
、
EID
50
或
LD
50
，然后计算中
和指数。

五、材料

1
、长满单层的细胞
1
瓶

2
、胰酶、吸球、吸管、生长液

3
、
96
孔细胞培养板

4
、加样器、枪头

5
、病毒液（
PRV
）

6
、待检血清、
PRV
阳性对照血清、
PRV
阴性对照血清

六、操作步骤

1
、固定病毒—稀释血清法

1
）
测定
病毒液的
TCID
50

2）将测好
TCID
50
的病毒液稀释成
200
个
TCI D
50
的病毒悬液。

3
）在
96
孔微量培养板中 将血清（预先
56
℃灭活
30min
）作连续倍比稀释（具体
方法< br>是在
96
孔板中先加入
50?l
生长液，再加
50?l
待检血清，混匀后，吸
50?l
至下一孔，如此下去。一直到
1
∶
256
），每个稀释度作
4
孔。

4）在上述各孔内加入
5 0?l
稀释好的病毒液，混匀后放入
37
℃
5%CO
2
培养箱中
作用
45min-60min
。
5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，
其中病毒对照要作< br> 200
个
TCID
50
、
20
个
TCID
50
、
2
个
TCID
50
、
0.2
个
TCID
50
4
个不同浓度的对照。

6）感作完成后每孔加入
100?l
细胞悬液，放
37
℃
5%CO
2
培养箱培养，逐日观察
并记录结果，一般要观察
5-7
天 。

7）结果计算，按
Reed- Muench
两氏法或
Karber
法进行。

累计

CPE
孔数

无
CPE
孔数

0
0
1
2
5
9
13
17
15
11
7
4
1
0
0
0
血清稀释度

1
∶
2
（
10
-0.3
）

1
∶
4
（
10
-0.6
）

1
∶
8
（
10
-0.9
）

1
∶
16
（
10
-1.2
）

1
∶
32
（
10
-1.5
）

1
∶
64
（
10
-1.8
）

1
∶
128
（
10
-2.1
）

1
∶
256
（
10
-2.4
）








=0.33
CPE
孔数

0
0
1
1
3
4
4
4
无
CPE
孔数

4
4
3
3
1
0
0
0
保护率
%
100
（
15/15
）

100
（
11/11
）

87.5
（
7/8
）

66.7
（
4/6
）

16.7
（
1/6
）

0
（
0/9
）

0
（
0/13
）

0
（
0/17
）

lgPD50=
高于
5 0%
的保护率的血清稀释度的对数
+
距离比例×稀释度对数的差

=-1.2+0.33
×
(-0.3)

=-1.299

距离比例
=
（高于
50%
的保护率
-50%
）< br>/
（高于
50%
的保护率
—
低于
50%
的保 护率）

=
（
66.7-50
）
/
（
66 .7-16.7
）

PD50=-1.299
的反对数
=0.05=1/20


即
1
∶
20
稀释的待检血清可保护
50%
的组织培养细胞免于出现
CPE
。

2
、固定血清——稀释病毒法

1
）将病毒作连续
10
倍稀释

2
）将稀释好的病 毒接种
96
孔板，每个稀释度接种一纵排共
8
孔，每孔
50
μ
l
，
做两块板子。在其中一块板子的每孔加入
50
μ
l< br>待检血清（试验组），另一
块板子的每孔加入
50
μ
l
正常血 清（对照组），混合后置
37
℃
5%CO
2
培养箱
作用
1h
。

3）然后在每孔中加入
100
μ
l
细胞悬液。