抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则

2021年2月27日发(作者：丙酸倍氯米松鼻喷雾剂)
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则


一、基本原则

1.
抗肿瘤药物分类

(1)
细胞毒类药物
(cytotoxic
agent)
：包括干扰核酸和蛋白质 合成、抑制拓扑异构
酶及作用于微管系统的药物等；

(2)
生物反应调节剂
(biological response modifier)
；

(3)
肿瘤耐药逆转剂
(resistance reversal agent)
；

(4)
肿瘤治疗增敏剂
(oncotherapy sensitizer)
；

(5)
肿瘤血管生成抑制剂
(tumor angiogenesis inhibitor)
；

（
6
）分化诱导剂
(differentiation inducing agent)
；

(7)
生长因子抑制剂
(growth factor inhibitor)
；

（
8
）反义寡核苷酸
(antisense oligonucleotide)
。


2.
抗肿瘤药物药效学需研究内容

2.1
包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。

2.2
评价药物的抗癌活性 时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以
做出正确的结论。

2.3
I
类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。



二、体外抗肿瘤活性试验

1.
试验目的


1.1
对候选化合物进行初步筛选；

1.2
了解候选化合物的抗瘤谱；

1.3
为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等

。


2.
试验方法

选用
10-15
株人癌细胞株 ，
根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，
按常规细胞培养法进行培养；
推荐使用四氮唑盐
MTT
还原法、
XTT
还原法、
磺
酰罗 丹明
B(SR
染色法、或
51Cr
释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作 用。
药物与细胞共培养时间一般为
48-72
小时，
贴壁细胞需先贴壁
24
小时后再给药。
试验应设阳性及阴性 对照组，
阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，
阴性对照为
溶媒对照。


3.
评价标准

以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得 到剂量效应曲线，然后采用
Logit
法计算半数有效浓度
(IC
50
值或
EC
50
值
)
。体外试验至少重复一次。

附注：评价药物抗癌活性的方法：

1. MTT
还原法

1.1
基本原理：


四氮唑
[MTT,3-(4, 5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium < br>bromide]
是一种
能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与
NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄
色的
MTT
转化成不溶性的蓝紫色的甲
[< br>月替
]
(formazan)
，而死的细胞则无此功
能。用二甲基亚 讽
(DMSO)
溶解甲
[
月替
]
后，在一定波长下用酶标仪 测定光密度
值，即可定量测出细胞的存活率。

1.2
操作步骤
:
1.2.1
选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含
10
％小牛 血清的
RPMI l640
培养基配成
5000
个／
ml
的 细胞悬液，
接种在
96
孔培养板中，
每孔接
种
200μl< br>，
37
℃，
5
％
CO2
培养
24 h
。

1.2.2
实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换 含等体积溶剂的
培养基，每组设
3
～
5
平行孔，
37
℃，
5
％
CO2
培养
4
～
5 d
。

1.2.3
弃去上清液，每孔加入
200 μl
新鲜配制的含
0.2 mg
／
ml MTT
的无血清培
养基．
37
℃继续培养
4 h
。小心弃上清，并加入
200 μl DMSO
，用微型超声振荡
器混匀后，
在酶标仪上以试验波长为
570 nm
，
参比波长为
450 nm
测定光密度值。

1.3
结果评定
:
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率％＝
(1- OD
实验
/OD
对照
) ×
100
％

以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反 应曲线，
从中求
出样品的半数杀伤浓度
IC50
。合成化合物或植物提取纯品 的
IC50
＜
10
μg
／
m1
或植物粗提物的
IC50
＜
20
μg
／
m1
时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作
用。

2.
生长曲线法的基本原理：

在最适条件下，
肿瘤细胞在培养液 中呈指数生长，
如取细胞数的对数与培养时间
作图可得一条直线，
故称此时为对数生长 期。
随着细胞密度不断增高，
由于代谢
产物的积聚及营养物的消耗，
细胞生长 逐渐减慢以致停止，
此时称高坪期或稳定
期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出 来。

3.
染料排斥试验的基本原理：

活细胞有排斥某些染料如 伊红、
台盼蓝、
苯胺黑等的能力，
而死细胞由于膜完整
性的破坏，可被着色。 因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着
色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的 细胞比例。

4.
集落形成法的基本原理：

克隆原细胞具有持续 增殖能力，
当单个细胞分裂
6
代或
6
代以上时，
其后代所组
成的群体
(
集落
)
便含
50
个以上细胞。通过集落 计数可对克隆原细胞作定量分析。
它反映了单个细胞的增殖潜力，
故能较灵敏地测定抗癌药的活 性，
日前被认为是
一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种 。

5. SRB
法的基本原理：

SRB(sulforhodamine
是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。

SRB
可与
生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在
515
nm波长的
OD
读数与细胞数呈良好
的线性关系。故可用作细胞数的定量。
M TT
法的一个缺点是
OD
值可随放置时
间而变，而
SRB
法 无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。

三、体内抗肿瘤试验

体内抗 肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，
其中至少一种为人癌裸小鼠移植模
型或其它人癌小鼠模型 。
试验结果三种模型均为有效，
再重复一次也为有效，
评
定该化合物对这些实 验性肿瘤具有治疗作用。


鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型 、
原位接种模型和中空
纤维测定
(hollow-fiber assay)
等方法。

1.
动物

动物要求健康，符合 等级动物要求，有实验动物合格证。雌雄均可，但同一批实
验中动物性别必须相同。小鼠鼠龄为
5-6
周，体重为
18-22
克。评价同一物质的
活性时，不同批次的实验必 须采用同一品系的小鼠。


2.
肿瘤模型

2.1
小鼠肿瘤模型


淋巴细胞白血病腹水瘤
L1210
和P388
、白血病
L-615
、宫颈癌
U14
、肝癌
H 22
、
Lewis
肺癌、黑色素瘤
B16
、网织细胞瘤
M5 076
、肠癌
26
、肠腺癌
38
、乳腺癌
CD8F1
、艾氏腹水瘤（
EAC
）
、肉瘤
-180
等，以及各种小鼠肿瘤的 亚型和耐药株
等。


2.2
人癌裸小鼠移植瘤模型


应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。

模型建立和使
用应注意：

(1)
移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应
予了解。

(2)
移植瘤复苏后一般应传
2-3
代后再用于体内抗肿瘤试验。

(3)
对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型

(4)
为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于

15-20
代


3.
试验过程

3.1
接种：

肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。


3.1.1
皮下肿瘤模型

选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，
颈椎脱臼处死，在无菌条件下
（超净台
或接种罩）
，用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开 皮肤，剥离肿瘤。将
瘤组织剪成
1.5 mm3
左右，
用套管针接种于动物一 侧或双侧腋窝皮下；
或制成细
胞悬液，
然后按一定比例加入无菌生理盐水，
一 般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为
（
1-5
）
×
106
。

3.1.2
腹水瘤模型

无菌条件下，
消毒动物 皮肤，
吸取生长良好的动物腹水，
以生理盐水按一定比例
稀释后接种于动物腹腔，接种 细胞数量一般为（
1-5
）
×
106
。


3.1.3
原位接种模型

原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物 的某脏器，
如将人肝癌接种在裸
小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励 使用的方法。主
要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。

3.2
动物分组

3.2.1
试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。

3.2.2
治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随
机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至
100
—
300mm3
后将动物随机分组。

3.2.3
动物数普通小鼠每组
10
只，裸鼠
6
只。

阴性对照组动物数为治疗组动物
数
×
实验组数
1/2
3.3
剂量设置

3.3.1
治疗组设高、中、低剂量治疗组， 一般按
4:2:1
设置，高剂量使用最大耐受
量或
LD10
的剂量。

3.3.2
阴性对照组给予相应的溶剂；

3.3.3
阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，

3.3.4
如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳
性对照药。


3.4
阳性对照药选择原则

疗效确切；与被试物质化学结构类似；与被试物质有类似的作用机理。

3.5
药物配制

溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量 酸
(0.1-0.5N HCl)
或碱
(NaHCO3
、
Na2CO 3
、
NaOH)
溶解，调节
pH
在
4.5-9.0
的范围
内。
用乙醇、
丙二醇、
吐温
80
、
DMSO
助溶的药物，
或用吐温
60
、
吐温
80
、
2-3%
淀粉、
0.5%
羧甲基纤维素制成混悬液的药物，
可腹腔注射或口服 ，
但必须设相同
浓度的溶剂对照组。
用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、
皮下或肌肉注射。

3.6
给药方案和给药途径

分组当日开始 给药，
根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。
给
药途径应与推荐临床 用药的途径相同。

给药次数较多，
或被试物质溶解性较差，