孟鲁司特纳咀嚼片PCR假阳性等问题

2021年2月24日发(作者：角膜炎治疗方法)

PCR
检测常见问题与解决途径


利用
PCR
方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳
性和假 阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性，
PCR
检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的
PCR
方法不但要求
特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴 性和非特异性
扩增。

本文对
PCR
检测中出现的假阳性、假阴性、 非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。

一、假阳性：


（一）假阳性现象

假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴 性对照中出现一个或几个阳性结
果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴 性对照可提示有无假阳性结果出
现。

（二）造成假阳性的原因

1.
样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严 溢于容
器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导 致标本
间污染；

2. PCR
试剂的污染：主要是由于在
PCR< br>试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液
被
PCR
核酸模板污染 。

3. PCR
扩增产物污染：这是
PCR
反应中最主要最常见的 污染问题。因为
PCR
产物拷贝量大
(
一般
为
1013拷贝
/ml)
，远远高于
PCR
检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR
产物污染，就可形成假阳性。


4.
气溶胶污染
：
在空气与液体面摩

擦时就可形成气溶胶
，< br>在操作时比较剧烈地摇动反应管
，
开盖时、
吸样时及污染进样枪的反复吸样都可 形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含
48000
拷贝，因而由
其造成的污染 是一个值得特别重视的问题。

5.
实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位 容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多
的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生 长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可
能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳 性对照的检验室，这个问题比较常见。

（三）假阳性问题的试验控制

在每 次
PCR
检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试
验全部过程的试剂没有受到污染
；
阳性对照样品检测为阳性时
，
表明
DNA
提取
（
RNA
提取
、
RNA
反转录 ）
、
DNA
扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成 立的前提下，才能对检测
样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。

造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：

1
、DNA
阳性对照：以含有目的片段的
DNA(
或质粒）
作为模板进行扩增 ，证明
PCR
试剂是否有效、
扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注 意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其
成为潜在的污染源）。

2
、
DNA
阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳 性
现象。

3
、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4
、
PCR
抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样 品
DNA
，如果未扩
增出目的片段，证明此待测样品
DNA
中存在< br>PCR
抑制物。

5
、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性， 说明
DNA
提取试剂可能受到污染。

6
、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。

如果
DNA
阳性对照扩增结果为阴性，或者
DNA
阴性对照和空白对照扩增 结果为阳性，则说明
PCR
试剂或扩增过程存在问题。

（四）假阳性解决途径

由于

PCR
的敏感性和效率特 别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。尤其
是
PCR
扩增产物 和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。

1
、规范实验室设计

实验室设置上分配液区、
DNA
提取 区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、
电泳区顺序，严禁倒流。在连续而独立 的空间中完成不同实验步骤。不同工作区域相互隔离，通过传递仓
传递。

PCR前处理区（样品制备室、
DNA
提取室）和
PCR
准备室设置正压通风系 统，并设置通风柜或生
物反应柜造成局部负压；后
PCR
室（
PCR
室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离
分子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。

配制
PCR
反应体系（配备冰箱及生物安全柜，此实验室要求无模板
DNA
存在）和向
PCR
反应体系
中加入模板
DNA
（配 备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。

2
、规范试剂耗材管理

1
）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；

2
）分装：双蒸水、 引物和
dNTP
均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外
灯的 超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。

3
）消毒：除酶及不能耐高温 的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。必要时，在加样本前，反应
管和试剂用紫外线照射，以破坏存 在的核酸。

3
、规范实验室操作

1
）控制污染源：PCR
产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；

2
）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；< br>
3
）定期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用
10%
漂白剂、3
％双氧水或专用商业产品清理实验室
台面及死角。

4
）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；

5
）小心 操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳
性对照。
4
、技术处理

1
）在

DNA
模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的

PCR
产物。一般选用波
长

254nm
照射

30min
（

Nature
，

1990
，

34:27
）；

2
）
PCR
实验中使用

dUTP
，而不用

dTTP
。在扩增前使用

UraciI N
一

g1ycosylase
（尿嘧啶
糖基化酶）处理可降解交叉污染的

PCR
产物，而不降解基困组

DNA
模板，然后热灭活此酶，再进行扩
增反应（

Gene
，
1 990
，
93
：
125
）。美国

PE
公司提供此类试剂盒；

3
）在

PCR
反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联

DNA
链，使
之不能再扩增（

Nucleic Acids Res
，
1991
，
19
：
99
）。


二、假阴性


（一）假阴性现象与判断方法

如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注
意，许 多国产
PCR
试剂盒中阳性对照采用质粒
DNA
，和标本相比来说，不需纯化 提取核酸的步骤，因此，
如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可 能有假阴性。

设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中同时对内标 准基因对照进行扩
增，若内标准基因对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。

（二）造成假阴性的原因


1
．

仪器因素

PCR
实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成< br>PCR
假阴性的因素。扩增仪的主要问
题是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。而离 心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用
离心加速度（
XXXg
）作为参 数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的
大小不同，有效跳心半径也 不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大
(
有的在数倍以上
)
，所以 在相
同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成

PCR
假阴性。这 个问题在其他实验也有，但因其他
实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。 建议使用小型台式离心机的实验要
注意一下这个问题。

2
．

试剂质量问题

PCR
实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题 涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽
提；引物位点的选择；
Taq
酶的活性等等。其 中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂
质量的问题，因此选用高质量的
PC R
试剂非常重要。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的 活性丧失或不够而导致假阴性。需
注意的是有时忘加

Taq
酶或溴乙锭。



引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是

PCR
失败或 扩增条带不理想、容
易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓 度低，造成低效率的
不对称扩增，对策为：

①

选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看
OD
值，更要注重引物原
液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一
条引物无条带，此时做

PCR
有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条 引物亮度高，一条亮度低，
在稀释引物时要平衡其浓度。

③

引物 应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导
致引物变质降解失效。



3
．

核酸模板问题

1
）模板中含有杂蛋白质；

2
）模板中含有

Taq
酶抑制剂；

3
）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；

4
）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；

5
）模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能 是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因
而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定 不宜随意更改。



4
、物理原因：
PCR
仪控温不准，也是

PCR
失败的原因之一。有时还有必要用标准的温度计，
检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。


5
、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因 靶序列某段缺失使引
物与模板失去互补序列，其

PCR
扩增是不会成功的。

6
．

操作人员素质问题

PCR
实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分 、循
环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。

（三）假阴性问题的试验控制

在每次
PCR
检测时，一定设立阴性 对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试
验全部过程的试剂没有受到污染
；
阳性对照样品检测为阳性时
，
表明
DNA
提取
（
RNA
提取
、
RNA
反转录）
、
DNA
扩增和电泳 鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测
样品进行判定。

造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：

1、
DNA
阳性对照：以含有目的片段的
DNA(
或质粒）
作为模 板进行扩增，证明
PCR
试剂是否有效、
扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的 片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其
成为潜在的污染源）。

2
、
DNA
阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过 程中无假阳性
现象。

3
、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4
、
PCR
抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样 品
DNA
，如果未扩
增出目的片段，证明此待测样品
DNA
中存在< br>PCR
抑制物。

5
、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性， 说明
DNA
提取试剂可能受到污染。

6
、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。

如果
DNA
阳性对照扩增结果为阴性，或者
DNA
阴性对照和空白对照扩增 结果为阳性，则说明
PCR
试剂或扩增过程存在问题。

（四）假阴性解决方案

1
．反应体系不灵敏：
1
）检查< br>PCR
试剂是否失效；
2
）检验引物是否降解：
3
）优化PCR
扩增体系
与程序。

2
、
PCR
反应存 在抑制物：
（
1
）
稀释模板
DNA
，进行扩增分析；
（
2
）
纯化模板
DNA
，除去蛋白质、
多酚、多糖等抑制 物；（
3
）检测
PCR
体系中是否含有扩增抑制物。

3< br>、
DNA
提取失败：
1
）选择与优化样品
DNA
提取 方法；
2
）验证
DNA
提取试剂是否失效。


三．非特异扩增

（一）现象

PCR
扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩
增带。非特异性条带的出现，

(
二）原因：

1.
引物设计与浓度问题
< br>引物设计：引物碱基的
G+C
含量以
40-60%
为宜，
G+ C
太少扩增效果不佳，
G+C
过多易出现非特异
条带。
ATGC最好随机分布，避免
5
个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构 ，
避免两条引物间互补，特别是
3'
端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的 扩增条带。引物
3'
端的
碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避 免因末端碱基不配对而导致
PCR
失败。引物
应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性。

引物浓度：每条引物的浓度
0.1
～
1umol
或
10
～
100pmol
，以最低引物量产生所需要的结果为好，引
物 浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。


2. Mg2+
离子浓度过高：在一般的
PCR
反应中，各种
dNTP
浓度 为
200umol/L
时，
Mg2+
浓度为
1.5
～
2.0mmol/L
为宜。
Mg2+
浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低
Taq DNA
聚合
酶的活性，使反应产物减少。

3.
退火温度过低
：
变性后温度快速冷却至
40
℃～60
℃
，
可使引物和模板发生结合
。
由于模板
DNA
比
引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与 时间，取决
于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于
20
个核苷 酸，
G+C
含量约
50%
的引物，
55
℃为选择最适退火温 度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：







Tm
值
(
解链温度
)= 4(G+C)
＋
2(A+T)






复性温度
=Tm
值
-(5
～
10
℃
)



在
Tm
值允许范围内，

选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，

提高
PCR
反
应的特异性。复性时间一般为
30
～
60sec
，足以使 引物与模板之间完全结合。


4. PCR
循环次数过多：

当其它参数确定之后，循环次数主要取决于
DNA
浓度。一般而言
25-3 0
轮
循环已经足够。循环次数过多，会使
PCR
产物中非特异性产物大量增加。通常经
25-30
轮循环扩增后，
反应中
Taq DNA
聚合酶已经不足，

如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的
DNA
样品稀
释10
-10
倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经
60
轮循环后，扩增水平可达
10
-10
。
3
5
9
10
扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示
:C
＝
Co (1+P)

。其中：
C
为扩增产物
量
,C0
为起始
DNA
量
, P
为增效率
, n
为循 环次数。在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反
应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明 显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的
低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较 高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，
减少非特异性产物。

5.
酶的质和量，催化一典型的
PCR
反应约需酶量
2.5U(< br>指总反应体积为
100ul
时
)
，浓度过高可引起
非特异性扩 增，浓度过低则合成产物量减少。

往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出
现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。


四．
PCR
扩增出现涂抹带

1
、原因：往往由于酶量过多 或酶的质量差，
dNTP
浓度过高，
Mg2+
浓度过高，退火温度过低，循环
次数过多引起。

2
、对策：

1
）

减少酶量，或调换另一来源的酶；

2
）减少
dNTP
的浓度；

3
）适当降低
Mg2+
浓度；

4
）增加模板量，减少循环次数。



五、标准问题

转基因成分检测一般按照标准方法进行，引物和
PCR
反应体系一般都经过了严格的循环验证。有时
标准方法可能存在问题，导致假阳性、假阴性、非特异性 扩增和涂抹带的产生。标准方法可能存在的问题
有：

1.
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行

PCR
扩增时，扩增出
的

PCR
产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

2. Mg2+
浓度不合理：

Mg2+
离子浓度对

PCR
扩增效率影响很大，浓度过高可降低

PCR
扩增的
特异性，浓度过低则影响

PCR
扩增产量甚至使

PCR
扩增失败而不出扩增条带。


3.
反应体积的改变：通常进行

PCR
扩增采用的体积为

20ul
、

30ul
、

50ul
。或

100ul
，应用
多大体积进行

PCR
扩增，是根据检测不同目的而设定，在做小体积如

20ul
后，再做大体积时，一定要
模索条件，否则容易失败。


温度设置不合理：变性对

PCR
扩增来说相当重要，如变性温度 低，变性时间短，极有可能
出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温 度过高影响引物与模板的结
合而降低

PCR
扩增效率。


六、检测极限问题

n
当样品中转基因成分很低时，反应体系内 可能不含有扩增模版，因而容易造成假阴性结果。
PCR
理
论检测极限是在反应体系中 存在一个拷贝的目标
DNA
分子，由于人的判读能力限制和
PCR
效率等原因 ，
定性检测实际极限值一般是理论检测极限值的
10-30
倍。也就是说，如果转基因 成分低到检测极限时，检
测不到转基因成分的可能性会很大，或者说出现假阴性的概率很大。出现假阴性 的原因是由于抽样误差，
反应体系中不存在有效扩增的模版分子。此时是不适合做
PCR
检测的。

根据作物基因组的大小，可以计算出不同作物的理论检测极限并估计出实际检测极 限。例如在
100
微升的反应体系中
，
小麦基因组有
0.58
万个拷贝
，
一个转基因拷贝的重量比
（理论检测极限）
是
0.01 74%
，
玉米的理论检测极限是
0.003
，
其他作物的理论检测极 限一般在
0.001%-0.01%
。
如果反应体系是
20
微升，< br>理论检测极限值将提高
5
倍，小麦为
0.085%
，玉米为
0 .015%
，

其他作物将在
0.005-0.05%
之间。反应< br>体系是
20
微升的定性检测实际极限值一般是在
0.05-0.5%
。 低于这个含量时，反应体系中有时不含扩增模
版
DNA
，因此很难得到正确的检测结果 。


七．

怎样查找污染源

如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。

（一）设立阴阳 性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，
且重复性好的样品， 因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含
靶序列的重组质粒为 对照，
100
个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因
为
PCR
敏感性极高，可以从其它方法（
Sourthern
印迹或点杂交等）检测阴性的标 本中检测出极微量的
靶分子。此外，每次扩增均应包括
PCR
体系中各试剂的时机对照，即包括
PCR
反应所需的全部成分，
而不加模板
DNA
，这对监测试剂中
PCR
产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结
果，就是某一种或数种试剂被污 染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应
管，每一管含有一种被检测试剂 ，在检出污染试剂后，应马上处理。

（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂 后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防
措施比较严密，则考虑可能为环境污染。环境污染中常见的污 染源主要有：
1.
模板提取时真空抽干装置；
2.
凝胶电泳加样器；
3.
电泳装置；
4.
紫外分析仪；
5.
切胶用刀或手术刀片；
6.
离心机；
7.
冰箱门把手，
冷冻架，门把手或实验台面等；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源：
1
）
用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污 染源；
2
）
0.1ml
去
离子水浸泡；
3
）取
5ml
做
PCR
实验；
4
）电泳检测结果。

8.
气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中
PCR < br>产物
的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物
（ 与原引物无相关性）
。


八．污染处理

（一）环境污染

1.
稀酸处理法：对可疑器具用
1mol/L
盐酸擦拭或浸泡，使残余
DNA
脱嘌呤；

2.
紫外照 射（
UV
）法：紫外波长（
nm
）一般选择
254/300nm，照射
30min
即可。需要注意的是，
选择
UV
作为消除残留
PCR
产物污染时，要考虑
PCR
产物的长度与产物序列中碱基的分布，
UV
照射
仅对
500bp
以上长片段有效，对短片段效果不大。
UV
照射时，
PCR
产物中 嘧啶碱基会形成二聚体，这
些二聚体可使延伸终止，但并不是
DNA
链中所有嘧啶均能形成二聚体，且
UV
照射还可使二聚体断裂。