减肥教程医学免疫学第五版电子书

2021年2月24日发(作者：女性尿结石的症状)
第二十二章

免疫学检测技术的基本原理

第一节


体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素

（一）抗原抗体反应特点

1
．高度特异性


抗 原与抗体的结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原
表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定的。< br>空间构型互补程度越高，
抗原表
位与抗体可变（
V
）区之间结合力越强 ，抗原抗体结合的特异性越强，亲和力也
越高。
利用这一特点，
在体外可以对许多未知 的生物学物质进行特异性鉴定。
如
利用抗伤寒杆菌的抗体检测伤寒杆菌；
也可用已知的 抗原
（如乙型肝炎病毒）
来
检测相应的抗体（抗乙型肝炎病毒抗体）
。

2
．表面化学基团之间的可逆结合


抗原抗体结合除了空间构 象互补外，主
要以氢键、
静电引力、
范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非 共价方
式结合。
这种非共价键不如共价键结合稳定，
易受温度、
酸碱度和离子 强度的影
响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。解离度主要取决于两个方面：
一是抗 体与抗原结合的亲和力（
affinity
）
。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位< br>与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。
抗体亲和力越高，
解离度越低；
反之
抗体的亲和力越低，
解离度越高。
二是抗原抗体反应的环境因素如温度、
酸碱 度
和离子强度。
因此在体外进行抗原抗体反应时，
要求适当的温度、
酸碱度和 离子
强度等条件。


1
K
（亲和常数）
=
2010-4-13
Ag+Ab
Ag Ab
7

3
．适宜的抗原抗体浓度和比例


抗原 抗体结合后能否出现肉眼可见的反应
取决于两者适当的浓度和比例。
在反应体系中，
如 果抗原与抗体的浓度和比例适
当则抗原抗体复合物体积大、
数量多，
出现肉眼可见的反 应。
若抗原或抗体过剩，
抗原
-
抗体复合物体积小、数量少，不能出现肉眼可 见的反应。故在具体实验过
程中要适当稀释抗原或抗体，
以调整两者浓度和比例，
使其 出现最大复合物，
避
免假阴性的发生。

抗体过剩
抗原抗体比例合适
抗原过剩
2010-4-13
8


2
4
．抗原抗体反应的两个阶段


抗原抗体 反应可分为两个阶段：第一个阶段
是抗原抗体特异性结合阶段。
抗原分子与抗体分子之间是互补 的非共价结合，
该
反应迅速，
可在数秒钟至几分钟内完成，
一般不出现肉眼可 见的反应。
第二阶段
为可见反应阶段，
是小的抗原抗体复合物之间靠正、
负电 荷吸引形成较大复合物
的过程。
此阶段所需时间从数分、
数小时至数日不等，
且易受电解质、
温度和酸
碱度等条件的影响。


（二）抗原抗体反应的影响因素

1
．电解质


抗原、抗体通常为蛋白质分子，等电点分别为
pH3~5
和
5~6
不
等，
在中性或弱碱性条件下，
表面带有较多的负电荷，
适当浓度的电解质会使他
们失去一部分的负电荷而相互结合，
出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。
实验中
常用
0.85%
的
NaCl
或其他离子溶液作稀释液，以提供适当浓度的电解质。


2
．温度


适当提高反应的温度可增加抗原 与抗体分子的碰撞机会，加速抗
原抗体复合物的形成。
在一定范围内，
温度越高，形成可见反应的速度越快。
但
温度过高（
56
℃以上）
，可使抗 原或抗体变性失活，影响实验结果。通常
37
℃是
抗原抗体反应的最适温度。

3
．酸碱度


抗原抗体反应的最适
pH
在
6~8
之间，
pH
过高或过低，均可直
接影响抗原、抗体的理化性质。此外 ，当抗原抗体反应液的
pH
接近抗原或抗体
的等电点时，
抗原抗体所带正、< br>负电荷相等，
由于自身吸引而出现凝集，
导致非
特异性反应，即假阳性反应。< br>
第二节


检测抗原和抗体的体外试验

抗原和其 相应抗体在体外相遇可发生特异性结合，
由于该反应是高度特异性
的，因此可以用已知的抗原（ 或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）
。由于抗原
物理性状的差异或参加反应的其他辅助成分的 不同，
可出现不同类型的反应。
如
凝集反应、
沉淀反应、
中和反应及 免疫标记技术等。
实验所采用的抗体常存在于
血清中（还可存在于关节液、脑脊液、腹水及胸水 中）
，因此习惯上将体外的抗
原
-
抗体反应称之为血清学反应（
se rological reaction
）或血清学试验。

1
．凝集反应（
agglutination reactions
）
：

细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包
被抗原 的颗粒状物质
（如聚苯乙稀乳胶等）
与相应的抗体在电解质存在的条件下

3
结合，
出现肉眼可见的凝集团现象，
称为凝集反应。
凝集反应分为直接凝集反 应
和间接凝集反应两种。

（
1
）直接凝集反应（
direct agglutination rea ctions
）
：颗粒性抗原本身直接与
相应的抗体反应出现的凝集现象，如红细胞凝 集或细菌凝集。


（
2
）间接凝集反应（
indirect agglutination r eactions
）
：将可溶性抗原或抗体
先吸附在某些颗粒载体上，
形成致 敏颗粒，
然后再与相应抗体或抗原进行反应产
生的凝集现象，称为间接凝集反应。
< br>直接凝集反应和间接凝集反应亦常用于溶血性疾病的诊断，
如
Rh
血型不符的新生儿溶血症及药物相关的溶血性疾病。

2
．沉淀反应（
precipitation reactions
）
：


毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

3
．免疫标记技术（
immunolabeling
techniques
）
：免疫标记技术是将抗原抗
体反应与标记技术相结合，
以检测抗原或抗体的 一类试验方法。
为了提高单纯的
抗原和抗体检测的灵敏性，
将已知的抗体或抗原标记上 示踪物质，
通过检测标记
物，
间接测定抗原抗体复合物。
常用的标记物有酶、
荧光素、
放射性核素、
胶体
金及化学发光物质等。
免疫标记技术极大 地提高了抗原抗体反应的灵敏度，
不但
能对抗原或抗体进行定性和精确定量测定，
而且 结合光镜或电镜技术，
能观察抗
原、抗体或抗原抗体复合物在组织细胞内的分布和定位。

（
1
）免疫酶测定法（
enzyme immunoassay
，
EIA
）
：这是一种用酶标记一抗
或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。常 用的有酶联免疫吸附试验（
enzyme
linked
immunosorbent assay
，
ELISA
）和酶免疫组化技术 。
ELISA
法需将抗原或
抗体与一固相载体
（常为聚苯乙烯板）
连 接，
然后再进行酶免疫反应。
酶免疫组
化法用于测定组织或细胞中的抗原。
酶 免疫检测技术可用于激素、
药物等半抗原
的检测，也可用于大分子蛋白质、病毒和细胞性抗原成 分的检测。由于
ELISA
检测技术方法简单、特异性强，因此是酶免疫技术中应用最广泛的技 术。

1
）双抗体夹心法（
sandwich ELISA
）


4

2
）间接
EILSA
3
）
BAS -ELISA
4
）微粒捕获酶免疫分析技术（
microparticle enzyme immunoassay
, MEIA
）

5
）免疫组化技术（
immunohistochemistry

technique
）

（
2
）免疫荧光技术（
immunofluorescence techn ique
）
：又称荧光抗体技术，
是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体 的方法。


（
3
）放射免疫测定法（
radioimmunoassay, RIA）
：是用放射性核素标记抗原
或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的 特异性结合起来，
具有重复性好、
准确性高等优点，
广泛应用于激素、
药物等 微量物质的检测，
敏
感性可达到
pg/ml
水平。常用的放射性核素有
131
I
和
125
I
等。


5 （
4
）
化学发光免疫技术：
（
chemiluminescen ce immunoassay
, CLIA
）
：
是将化
学发光分析 和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。
该方法不仅具有
发光分析的高灵敏度和抗原 抗体反应的高度特异性，
而且还具有分离简便、
可以
实现自动化分析的特点。
将发光物质如鲁米诺，
标记抗体或抗原进行反应，
以发
光现象作为抗原
-抗体反应的指示系统，可定量检测抗原或抗体。包括发光酶免
疫分析、化学发光免疫分析和电化学发 光分析。


（
5
）免疫胶体金技术：
（
immunological colloidal
gold signature, ICS
）
：用胶
体 金颗粒标记抗体或抗原，
以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。
氯
金酸（< br>HAuCl
4
）在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电
的 疏水胶溶液。
该溶液因静电作用而呈稳定的胶体状态，
故称胶体金。
在碱性条
件下，
胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团靠静电引力结合。
由于胶
体金的 电子密度高，
颗粒聚集后呈红色，
因此可用于标记多种大分子，
如白蛋白、
免 疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。

（
6
）免疫印 迹技术（
immunoblotting
）
：又称
Western blot ting
，是将十二烷
基磺酸钠（
SDS
）聚丙烯酰胺凝胶电泳（
P AGE
）分离得到的按分子量大小排列
的蛋白转移到固相载体膜上，
再用标记的特异性 的抗血清或单克隆抗体对蛋白质
进行定性及定量分析的技术，其鉴定蛋白质的敏感性为
1
～
5ng
。该技术已被广
泛地用于医学研究领域。
免疫印迹法的基本步骤为 ：
第一步是电泳分离蛋白抗原，
将可溶性抗原或溶解状态的细胞裂解液进行
SDS- PAGE
。
第二步是将
SDS-PAGE
分离的蛋白条带转移至固相的硝酸纤 维素膜
（
NC
）
或聚偏二氟乙烯
（
PVDF
）上。
第三步，
转印到膜上的蛋白条带可用酶标记的一抗或二抗进行特异性反应，
加 入
显色底物以显示结果。


6