祛痘印最有效的方法菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

2021年2月23日发(作者：脊柱脊髓损伤)
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菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

一、实验目的

1
、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。
2
、学习酶活力测定的方法。

3
、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4
、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5
、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理


菠萝蛋白酶
(Bromelain
，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素
)
是从菠萝果茎、叶、
皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天 然植物蛋白酶。
分子量为
33 000 ,
等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末， 溶于水。水溶液无色至淡
黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白，能分解蛋白质、脂 类和
酰胺等。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工
,
采用超滤方法进 行过滤浓缩
,
低温冷
冻干燥而得的。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、
啤酒澄清
.
还用于明胶、
水解蛋白
的生产
,
在医 药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。因此可以治疗水肿及多种炎症
,
它能迅速溶痂。对 正常组织无害
,
不影响植皮
,
适用于中小面积深度烧伤的治疗。





1
、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提 取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋
白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的 活力。





2
、本实验采用离子交换技术纯 化菠萝蛋白酶。与化学方法相比，它分离条件温和，不
引起分子结构的变化。
它用于纯化菠萝蛋 白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交
换条件。




3
、
菠萝蛋白酶活性单位的定义：
一个酶活力单位
（
U）
定义为特定条件下
[
，
(37±1℃
)]
酶作用于干 酪素底物
1min
产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，
生成在三
氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在
275 nm
处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光
度计
(275 nm)
测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法
[91 ]
。
每毫升酶液活性单位（
U/ml
）
=A-
A0/Aw× M 标×V/t×样品稀释倍数
/
供测体积式中：
( A -
A0)
为
275nm
波长下待测酶液与对照的光密度差值；
Aw
指以水为对照，
275nm
波长下
50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；
M
标为标准酪氨酸溶液浓度；
V
为反应体系总体积
（
mL
）；
t
为反应时间
10min
。

4
、修饰的菠萝蛋白酶对温度和
pH
值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋
白酶是一种巯基蛋白酶
,
但它的稳定性较差
,
影响了它的应用。
此外
,
菠萝蛋白酶 易受有关因素
的影响而失活。聚乙二醇
(PEG)
为一种无毒且具亲水性的免疫惰性 大分子，本实验采用聚
乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰
,
提高了其对环境的稳定性
,
使其半衰期延长。

三、实验材料

（一）试剂和材料

1
、新鲜菠萝
(0.735kg)
2
、
ml
牛血 清蛋白柠檬酸钠、
单宁、
%EDTA
溶液、
%
氯化钠溶液、
1%
酪蛋白溶液、
1mol/L
氢氧化钠溶液、
L
磷酸缓冲液、激活 剂、考马斯亮蓝、
Brolain
试剂、
L
柠檬酸盐缓冲液、
PEG
活性酯、
50%
乙二醇、
50%
甘露醇、
50%
葡 萄糖溶液、
50%
甘油溶液

（二）实验仪器

榨汁机；离 心机；紫外可见分光光度计（
1cm
石英比色皿）
；恒温水浴锅（
37
℃）
；试
管、试管架；烧杯、容量瓶；移液管；离子交换柱
(250
×10mm)
；蠕动泵；自动部分收集
器

四、实验方法

1
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（一）从菠萝中提取、纯化菠萝蛋白酶

操作步骤：






将菠萝切碎→
加柠檬酸钠，榨汁
→
菠萝汁
→
纱布过滤
→
澄 清液
→
2000r/min
，
7min
离
心
→上清液
→
加
Vc,%
单宁溶液搅拌
15min,
静置< br>40min4200r/min,5min
离心
→
沉淀物
→
加
%EDTA
溶液，
%
氯化钠液
→
4200r/min,5m in
离心
→
酶复合物
→
加适量
%
氯化钠溶液，4000r/min,7min
离心
→
酶复合物沉淀
→
冻存备用


经预处理的强酸型阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别装 入
250mm
×
10mm
的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长径比为20
∶
1
，将两柱串联。在
常温下依次操作：





加样：略微增大层析柱出口的流速，
排除凝胶床表面缓冲液。
打开层析柱顶塞，用移液
管量取菠萝蛋白酶粗品溶液，
从交换柱顶部加入，
使 其沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢
流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将 样品溶液加到凝胶表面，
最好避免破坏凝胶，
以保持凝胶表面平坦。
打开层析柱出口，
让蛋白质样品溶液进入凝胶柱
床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关 上层析柱出口。

洗脱：加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充 分平衡，
在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入
1MNaCl~2 0mM
醋酸缓
冲液（含
%EDTA
）以
1mL/min
流速，开始洗脱

部分收集：
用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。
将洗脱液按一定的体积分别收集于
试管中，收集各洗脱液，然后逐管进行分析。

检 测：洗脱流出液连续通过紫外检测仪，在选定波长下测定其吸光度
A
，并自动绘制洗
脱 曲线。洗脱流出液经沉淀、干燥，得到菠萝蛋白酶精品。

（二）菠萝蛋白酶活力的测定






精确移取

的干酪素溶液
5mL
于
15mL
具 塞的试管中，置于
37
℃恒温水浴中保温
10min
，
准确取一定量 的供试菠萝蛋白酶液，
用酶液激活液
（

用
L-cys
和
EDTA-2Na
配制）
稀释至
1mL
，
加入 上述底物溶液中，摇匀，立即置入
37
℃恒温水浴中，准确反应
10min
， 加入
5mL
三氯乙
酸溶液，终止反应，用力混匀，在
37
℃恒温水 浴中静置保温
30min
，待蛋白凝聚沉淀，然后
冷却至室温，
于
3 500rpm
离心
10min
，
取上清液于
275nm
波长下测其吸光度值
A
。
另取等体积
的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液 和三氯乙酸的加入顺序，测得的吸光度记为
A0
。

（三）物理及化学因素对菠萝蛋白酶稳定性的影响

菠萝蛋白酶酶活力测定采用连续测定法，以酪蛋白为底物，经菠萝蛋白酶水解后用紫外分

2
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光光度计测定吸光值，每五分钟测定一次，大致表示为酶活性。

、不同温度下的酶活性变化：







温度（
℃
）

15




吸光度值







PH
值





吸光度值






、不同
PH
值下得酶活性











25

40

50

60

70

、在以上实 验的相同条件下，在测定所用的酶试剂中分别加入
1-2
滴
50%
甘油溶液， 然后与
之前相同进行测定酶活性变化情况。
50%
乙二醇、
50%
甘 露醇、
50%
葡萄糖溶液之后与
50%
甘
油溶液相同处理进行实验。

试剂

吸光度值

50%
甘油溶液


50%
乙二醇溶液


50%
甘露醇溶液


50%
葡萄糖溶液



（四）
NEM
修饰及修饰与未修饰酶的活性比较：


修饰酶的制备





60gNEM
溶于
40ml
干燥吡啶，
加入
1.01g
琥珀酸酐，
60
度保温
2h
，
在
60
度减压蒸馏除去
溶剂。 加入苯至残余物溶解，再加
100ml
冷己烷，
4
度振荡
2h
。过滤，残渣溶于蒸馏水后透
析，冻干。将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入
L
柠檬 酸缓冲液（
PH
）
，
4
度反应
4h
。产物
在
PH
柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得
NEM-
菠萝蛋白酶（修饰酶）
。


修饰与未修饰酶的活性比较

（
1
）分别取修饰酶与未修 饰酶，溶解于
L
磷酸缓冲液中（
PH
）至
10ml
，离心得上清液

（
2
）取
15
支试管，分为三组，每组
5
支，分别按下表操作：

组
1
：

试管号

所加试剂

激活剂（
ml
）


组
2
：

试管号

所加试剂

修饰酶（
ml
）

激活剂（
ml
）

组
3
：

试管号

所加试剂

缓冲液（
ml
）

激活剂（
ml
）


3
1
1

2
1


3
1


4
1


5
1


1
1

2
1


3
1


4
1


5
1


1
2
1


3
1


4
1


5
1


未修饰酶（
ml
）

1

1%
酪蛋白（
ml
）


1%
酪蛋白（
ml
）


1%
酪蛋白（
ml
）