不孕不育长春奶粉中蛋白质含量的方法[

2021年2月23日发(作者：肾上囊肿)

【摘要】

目地

尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量地方法
.
方法

使用 三氯乙酸
沉淀蛋白质后
,
运用
BCA<
二喹啉甲酸）法
,< br>在
570 nm
波长处
,
分别测定标准蛋白质应用液与
样品稀 释液地吸光度值
,
基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系
,
计算出 样品中
蛋白质地含量
.
结果

待测溶液中蛋白质浓度在
0
～
250 μg/ml
范围内标准曲线 呈线性关系
,
其
回归方程为：
Y=301.12X-73.42,
相 关系数
r=0.998,
平均回收率为
100.2%.
结论

结合三氯乙
酸沉淀地
BCA
法适用于奶粉中蛋白质地快速检验和掺伪检验
.
【关键词】

奶粉；蛋白质；
BCA
法；三氯乙酸；三聚氰胺

A rapid and simple method of protein determination in powdered milk
b5E2RGbCAP
Zhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang Gang
First Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical
University, Hefei 230001
［
Abstract
］
Objective To explore a rapid and simple method
of protein determination in powdered milk without other nitrogen-containing compound
disturbance in Kjeldahl s Conjugated with protein precipitation with
trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid> method was used. According to the positive
relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protein content was
calculated in powdered s Protein content in milk solution showed a good
linear relationship at the detection ranges of 0-
250 μg/ml, with regression equation:
Y=301.12X-73.42 and related coefficient: 0.998, and the average recovery rate was
100.2%.Conclusion BCA method conjugated with trichloroacetic acid is adaptable to the
rapid and sensitive determination of protein in powdered milk.


［
Key words
］
Powdered milk
。
Protein
。
BCA method
。
Trichloroacetic acid
。
Melamine
p1EanqFDPw

蛋白质是人类最重要地营养物质之 一
.
因此
,
蛋白质含量一直是食品检测中地重要指标
.
目< br>前蛋白质定量方法较多
,
如凯氏定氮法、紫外分光光度法和
Lowry 法等
.
虽然凯氏定氮法目
前是测定蛋白质含量地国家标准方法
,
但其操作繁琐费时
,
且蛋白质含量是通过测定氮地含
量推算得来地
,
容易被其他含氮物质干扰
<
如
2008
年
9
月
“< br>问题奶粉
”
地出现源于有人利用凯
氏定氮法地缺陷
,
向牛奶中 添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；
Lowry
法和紫外分光光度
法存在显色所需时 间长
,
灵敏度低
,
稳定性差等缺点［
1
］
.
为弥补这些不足
,
本实验利用
BCA<
二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法 建立一种快速简便地测定奶粉中蛋白质含量地
方法
.
DXDiTa9E3d

1
材料与方法



1.1
仪器与试剂



1.1.1
仪器



酶标仪
<
型号
ELX800, BIO-TEK INSTRUM ENTS
公司）
,96
孔微孔板
,
化学分析滤纸
<
直径：
9 cm,
最大孔径：
10 μm
,
杭州新华纸业有限公司）
,
玻璃漏斗、烧杯等
.
RTCrpUDGiT


1.1.2
试剂



光明全脂速溶奶粉
<
黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司
,
产地：齐齐哈尔
,
生产日期：
20081010
）
,
蒙牛学生多维高钙高锌奶粉
<
内蒙古 伊利实业集团股份有限公司
,
产地：呼和
浩特
,
生产日期：
20081207
）
,
尿素
<
分析纯
,
上海苏懿化 学试剂有限公司）
,
三聚氰胺
<
化学
纯
,
上海凌峰 化学试剂有限公司）
,
硝酸铵
<
分析纯
,
汕头市西陇化工厂 有限公司）
,
三氯乙酸
<
分析纯
,
国药集团化学试剂有限公 司）
,BSA<
牛血清清蛋白
,
美国
Sigma
公司）BCA
试剂盒
公司
,BCA23225
）,
去离子水
.
5PCzVD7HxA


1.2
实验方法



1.2.1
方法原理



据资料介绍
,BCA
法是目前已知地一种敏感准确地蛋白质测试 法
,
广泛用于国内外企业
和科研院所进行蛋白质含量检测
.
其主要原 理是：要分析地蛋白质在碱性溶液里与
Cu2+
反
应产生
Cu+ ,Cu+
与
BCA
形成一种紫色化合物
,
其吸收峰在
562 nm
波长处
.BCA
法定量分
析蛋白质具有准确灵敏
<20
～
2 000 μg/ml
）、快速
<
约
40 min
）、 稳定和经济实用
<
可以用
试管或微孔板测定）
,
以及它是反应物与蛋 白质直接作用
,
对铵盐类等含氮化合物地抗干扰
能力较强等特点
.


三氯乙酸沉淀蛋白质地主要原理：三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使
蛋白质 构象发生改变
,
暴露出较多地疏水基团
,
使之聚集沉淀
.
据 文献报道
,
三氯乙酸比硫酸铜
等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮地影响,
具有广泛地适用性
.
jLBHrnAILg


1.2.2
标准应用曲线地绘制



配制
2 mg/ml
牛血清清蛋白
）溶液作为标准蛋白质储 存液
<
含有
9 g/L
氯化钠）
,
参照
BCA< br>试剂盒说明书所示方法
,
按表
1
所示配制不同浓度
BSA工作液
,
用定性滤纸过滤
,
收集滤液并记录体积
,
取其 中
200 μl
滤液加入等体积地
10%
三氯乙酸溶液
,
充 分反应后
12
000 r/min
离心
30 min,
吸取上清液待测；以
9 g/L
氯化钠溶液为空白对照
,
吸取上述滤液及
其三氯乙酸沉淀后地上清液各
25 μl
加入微孔板上相应地各个微孔中
,
每孔还加入
200 μl A
液与
B
液
<10A
∶
1B
）地混合工作液
,60< br>℃水浴
30 min,
用酶标仪在
570 nm
波长下测定各个
微孔中溶液地吸光度
,
以吸光度为纵坐标
,
蛋白质质量浓度为横坐标
,
计算标准回归方程并绘
制工作曲线
.
表
1
不同浓度
BSA
工作液地配方
<
略）
xHAQX74J0X


1.2.3
样品制备与测定



准确称量牛奶粉
150 mg/
份和
300 mg/
份各
4
份
,
分别倒入贴有
1
、
2
、
3
、
4
、
5
、
6
、
7
、
8
标 签地
8
个
50 ml
离心管中
,
再分别称量
20 mg
地硝酸铵、三聚氰胺和尿素各
2
份
,
按
表
2< br>示倒入对应地离心管中
.
加入适量
60
℃
9 g/L
氯化钠溶液充分溶解
,
并用
100 ml
容量瓶
定容至刻度
.
用定性滤纸过滤
,
收集滤液并记录体积
,
取其中
200 μl
滤液加入等体积地
10%
三
氯乙酸溶液
,
充分 反应后
12 000 r/min
离心
30 min,
吸取上清液待测；以
9 g/L
氯化钠溶液
为空白对照
,
吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后地上清液各
25 μl
加入微孔板上相应地各个
微孔中
,
每孔还加入
200 μl AB<10A
∶
1B
）混合液
,60
℃水浴
30 min,
用酶标仪在
570 nm
波
长下测定各个微孔中溶液地吸光度
,
从标准工作曲线上查出对应地蛋白质浓度
.
表
2
待测样
品组成
<
略）
LDAYtRyKfE


1.2.4
分析结果地表述与计算



样品中蛋白 质地含量
X
按式
(1>
计算：
X=10C·
F (1>,
式中：
X-
样品中蛋白质地含
量
,g/100 ml(g> ,C-
测定样品溶液中蛋白质含量
）
,F-
稀释倍数< br>.
Zzz6ZB2Ltk


1.2.5
允许差



同一样品地两次测定结果之差
,
不得超过平均值地
51%.

2
结果



2.1
标准工作曲线及线性范围



以
BSA
各级工 作液地蛋白质浓度
μgmoL
-1
）对其
OD
值）作图
,
结果表明蛋白质
浓度在
0
～
25 0 μg/ml
范围内标准工作曲线呈线性关系
,
标准曲线方程：
Y=301 .12X-73.42,
相关系数
r=0.998.
见附图
.
附图< br>
蛋白质含量测定地标准曲线
2.2
样品测定中干扰因素地影
响

取上述添加了不同干扰物质地样品
,
按上述实验方法进行操作
,
结果发现
,
在
60
℃地 水中
三聚氰胺等添加物质都能充分溶解
,
只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺地 奶粉溶液
过滤速度最快
<3
号和
7
号管分别用时为
19 min
和
21 min
）
,
添加了尿素地奶粉溶液次之
<4
号和
8
号管分别用时为
79 min
和
92 min
）
,
添加了硝酸铵地奶粉溶液最慢
<2
号和
6
号管分别用时为
112 min
和
124 min
）
.


分别收集滤液和三氯乙酸沉淀后地上清液进行
BCA
法检测蛋白 质含量
,
测得各项实验数据如表
3.
结果发现三种不同地非蛋白质地含氮化合 物基
本不影响蛋白质含量地正确测定：质量
150 mg
地奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质
含量为
35.72 mg,
标准方差为
1.38 mg
；质量
300 mg
地奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋
白质含量为
62.13 mg,
标准方差为
1.43 mg
；分别与空白对照地
34.96 mg
和
65.56 mg,
以
及厂家奶粉中蛋白质标示量
36 mg
和
72 mg
相比
,
二者差异都不明显
.
同时 实验结果也表明
本实验所用奶粉地蛋白质含量达到国家要求
<
我国《食品营养标签管理 规范》地技术附件
中规定
,
对于蛋白质和碳水化合物
,
其允许地误差 范围是
≥80%
标示值）
.
表
3
不同样品蛋白
质含量测定
<
略）
dvzfvkwMI1


2.3
方法地加标回收率



分别取奶 粉
1<
光明全脂速溶奶粉
,
其稀释液为稀释液
1
）和奶粉< br>2<
蒙牛学生多维高钙
高锌奶粉
,
其稀释液为稀释液
2
）加入
60
℃
9 g/L
氯化钠溶液进行
1/1 000样品稀释
,
做方法
加标回收实验
,
结果见表
4,
该方法地平均加标回收率为
100.2%.
表
4
方法地加标回收率
rqyn14ZNXI


3
讨论


奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作地一项重要指标
.
目前国内主要采用常规凯氏定氮法
,
国外也多采用常规或改良地凯氏定氮法测定食品 中蛋白质含量
,
但此法费时、费水、费电
,
操作繁琐
,
试 剂消耗量大
,
且不能有效区分非蛋白氮［
2
、
3
］
.
常见地含氮化合物如硝酸铵和
尿素比牛奶蛋白质地含氮率都高
,
易溶于水< br>,
很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常
温和冷水状况下在水中地溶解度非常低［
4
］
,
但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求
用温开水冲调,
例如
60
℃时三聚氰胺在
100 g
水中可以溶解
1.8 g,100
℃时溶解
6.4 g,
因而
掺伪问题容易受到人们地忽视
.
EmxvxOtOco

国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法地研究
,
例如
,云南工业大学张
惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质 测定
地影响
,
结果表明：用
95%
乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白 进行分离
,
回收率较高
,
并能方
便、快速测定掺入量
.对掺入硫酸铵等无机铵盐地测定
,
采用加
MgO
调到弱碱性
,< br>直接蒸馏测
定［
5
］
.
成都理工大学李海玲等通过对
Lowry
法、
BCA
法、磺基水杨酸沉淀法、
Bradford
法 等
4
种常用蛋白浓度测定方法地研究认为
,
确定
PEG-IL-6< br>地最佳蛋白浓度测定方法为
BCA
法
,
而包涵体变性液中地蛋白浓度只 能用
Bradford
法测定［
6
］
.
中国农业大学食品科
学与营养工程学院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法对添加了非蛋白氮
地液态 奶进行蛋白氮测定
.
结果表明
,
三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液 态奶蛋
白氮测定地影响［
7
］
.
河北省衡水市疾病预防控制中心田志 梅等分别运用紫外分光光度法
及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量
.
结 果显示
,
两种方法均可有效解决非
蛋白质类含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果地干扰问 题［
8,9
］
.
中国农业大学侯彩云等使
用三氯乙酸使蛋白质沉淀后
,
不同含量地蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同地
蓝紫色地络合物
,
根据其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关关系
,
用计算机软件自动分析
获得地样品色度值
,
从而计算出蛋白氮含量［
10
］
.
Si xE2yXPq5

综上所述
,
目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量 地方法有多种
,
其测定原理及结果地准确
性各不相同
,
每种方法都有 其优点及局限性
.
相比较而言
,
本工程运用
BCA
法结合三 氯乙酸沉
淀蛋白法检测奶粉中蛋白质地含量
,
可以有效排除三聚氰胺等非蛋白氮地干扰
,
具有简便、
快速、准确、实用地特点
,
可作为检测机构和平时人们 准确检测蛋白质含量时考虑运用地方
法之一
.
6ewMyirQFL
奶营养 成分很高
,
富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等
,
是人们生活中地主要要营养 食品之一
.
因此
,
分析牛奶中地营养成分含量是很有必要地工作
.< br>本实验在普通实验室条件
,
采用简单科
学快捷地方法分析某品牌牛奶中部分成分 含量
.
摘要：
牛奶营养成分很高
,
富含蛋白质和微量
元素钙 、铁、锌等
,
是人们生活中地主要要营养食品之一
.
因此
,
分析牛奶中地营养成分含量
是很有必要地工作
.
本实验在普通实验室条件
,< br>采用简单科学快捷地方法分析某品牌牛奶中部
分成分含量
.
关键字：
牛 奶

蛋白质钙铁锌
1
、实验目地
用分光光度法测某牛奶中蛋白质、
钙、铁、锌地含量
.
2
、实验原理
牛乳中地主要地蛋白质是酪蛋白< br>,
含量约为
35g/L
.
酪蛋白是
一些含磷蛋白质地混合物< br>,
等电点为
4.7
.
利用等电点时溶解度最低地原理
,
将牛乳地
pH
调至
4.7
时
,
酪蛋白就沉淀出来
.
用乙醇洗涤沉淀物
,
除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白
.
双缩脲< br>(NH
2
CONHCONH
2
>
在碱性溶液中与硫酸铜反应生 成紫红色化合物
,
称为双缩脲反应
,
蛋白质
分子中含有许多肽键在碱 性溶液中也能与
Cu
2+
反应产生紫红色化合物
.
在一定范围内,
其颜
色地深浅与蛋白质浓度成正比
.
因此
,
可以利用 比色法测定蛋白质浓度
.
双缩脲法是测定蛋白
质浓度地常用方法之一
.
操作简便、迅速、受蛋白质种类性质地影响较小
,
但灵敏度较差
,
而
且特异性不高
.
除
-CONH-
有此反应外
,
-CONH
2
、
-CH
2
NH
2
、
-CS- NH
2
等基团也有此反应
.