串联质谱

2021年2月22日发(作者：面条的热量)
串联质谱技术在新生儿疾病筛查中的应用



遗传性代谢病
( inborn error of metabolism
，
IEM)
是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素
循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代 谢的疾病。其种类繁多，是儿科临床的疑难杂症。
虽然其单一病种患病率较低，
但总体发病率较 高，
对人口素质、
家庭乃至社会的发展构成了
极大的威胁。其诊断主要依赖实验室的特 异性检查。我国每年出生约
2200
万新生儿，仅高
苯丙氨酸血症（包括苯丙酮尿症） 这类疾病，每年就新增患儿
1600~1800
例。
LC-MS/MS
技术的 发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。
即在新生儿出生后体内某些代谢产物
出现异常< br>,
而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断，并进行及时而有效的对
症治疗 ，
以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害，
进而保障儿童正常的体格发育和智能发
育 。
这就是新生儿疾病筛查
（
neonatal screening
）
。
国际新生儿疾病筛查发展趋势逐步提高到
以串联质谱（
MS/MS
）技术 为中心的筛查，如欧美等国目前已经广泛采用
LC-MS/MS
法对
新生儿遗传疾病筛 查。串联质谱即两个质谱仪串联后一次进行二级质谱检测
,
利用超敏性、
高特异性、< br>高选择性和快速检验的串联质谱技术，
能在
2~3 min
内对
1个标本进行几十种代
谢产物分析，通过对这些产物的分析
,
可以对
40< br>种左右遗传性代谢病
(
包括氨基酸代谢紊乱、
有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱 性疾病
)
进行筛查和诊断。
2004
年
12
月美国食品药品 管
理局（
FDA
）专门制订了“用串联质谱法分析新生儿氨基酸
,
游 离肉毒碱和酰基肉碱筛选检
测系统”的指导性文件。串联质谱技术不仅实现了“一项实验检测一种疾病” 向“一项实验
检测多种疾病”的转变，提高了检测的效率
,
同时使筛查过程中常见的假 阳性或者假阴性的
发生率显著降低
,
使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新 的水平。串联质谱在临
床遗传性代谢病高危患儿选择性筛查方面也发挥着重要作用，
上海第二医 科大学附属新华医
院新生儿筛查中心检测了
1000
多例全国各地送检的遗传性代谢病 高危标本，发现阳性标本
达
9%
~10%
，在
22700
例新生儿中筛查出阳性病例
6
例。因此，串联质谱技术是目前开展
新生儿筛查和临床遗 传性代谢病高危患儿筛查诊断较好的方法和发展方向。目前，
LC-MS/MS
技术检测相对发 生率比较高的一些新生儿代谢疾病如下：
中链脂肪酸脱氢酶缺乏
症、短链脂肪酸脱氢酶缺乏症、 长链脂肪酸代谢异常、卡尼丁（肉碱）吸收障碍、卡尼丁结
合酶缺乏、卡尼丁穿透障碍、丙酸血症、甲基 丙二酸血症、异戊酸血症、戊二酸血症、
3-hydroxy-3-methylglutaric a ciduria
、中链槭糖尿症
(MCAD)
、短链槭糖尿症
(SCAD)< br>、长链槭
糖尿症
(LCAD)
、超长链槭糖尿症
(VLCAD)
、瓜氨酸血症、酪氨酸代谢紊乱、高胱氨酸尿、
高苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥铂酸尿症、 高甲硫氨酸血症、苯丙酮尿症、
Argininosuccinic
acidemia
、
非
酮
性
高
甘
胺
酸
血
症
、
Glutaric
Acidemia
、
3-Hydroxy-3-methylglutaryl- CoA-
lyase
De?ciency
、
?
-
Ketothiolase
De?ciency
、
Multiple
Carboxylase De? ciency
等。
检测方法与原理：
方法一，
衍生化法：
通过把样品 进行
“一步法”
衍生，可以减少干扰，提高灵敏度。取
1~2
个滤纸血点(
直径
3
mm
的干血滤纸片，相当于
3.2 ?
L< br>全血
)
，
置于
96
孔过滤板中，
每孔加入含氨基酸和 酰基肉碱同位素内标的无水甲醇
100
?
L
，室温放置
20 mi n
，以提取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后离心至另一个
96
孔板中，
氮气 保护下
50
℃吹干，加入
60 ?
L
正丁醇（
（含
3 mol/L HCl
）
，密封，
65
℃孵育
15 min
进行
衍生化。氨基酸衍生反应：





R = H ,
氨基乙酸





R = (CH2)2CO2H ,
谷氨酸
R = CH3 ,
丙胺酸





R = (CH2)2SCH3 ,
蛋氨酸
R = CH(CH3)2 ,
缬氨酸





R = CH2C6H5 ,
苯基丙氨酸
R = CH2CH(CH3)2 ,
亮氨
酸




R = CH2C6H5OH ,
酪氨酸
R = CH2OH ,
丝氨酸





R = (CH2)3NH2 ,
鸟氨酸
R =
CHOHCH3 ,
苏氨酸
R = (CH2)4NH2,
赖氨酸


R = (CH2)3NHCONH2 ,
瓜氨酸
R=OH,
肉碱






R=OCO(CH2)6CH3,
辛
基
肉
碱
(MCAD),
(MADD)R=OCOCH2CH3,
丙
基
肉
碱
(CMA)


R=OCO(CH2)12CH3,
十四烷基肉碱
(LCAD),
(LCHAD)R=OCO(CH2)2CH3,
丁基肉碱
(SCAD)


R=OCO(CH2)16CH3,
十八烷基肉碱
R=OCO(CH2)4 CH3,
己基肉碱
(MACD)
衍生后的溶液，在
氮气保护下
50< br>℃吹干。用
100
?
L
流动相
(
一般为
80
％乙睛＋
20
％水＋
0.02%
甲酸
)
再溶解 残
渣，取
20 ?
L
进样，进行
FIA-MS/MS
分析。 方法二，非衍生化法。取
1~2
个滤纸血点
(
直径
3 mm
的干血滤纸片，相当于
3.2 ?
L
全血
)
，置于96
孔板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱
同位素内标的无水甲醇
100
?
L
，室温放置
30
min
，提取血片中的氨基酸和酰基 肉碱，然后
转移上清液至另一个
96
孔板中，
取
20 ?
L
进样，
进行
FIA-MS/MS
分析。
新生儿疾病筛查 的
MS/MS
分析，主要同步执行
3
个扫描模式：母离子扫描
(PS )
、中性丢失扫描
(NL)
和多反应
检测扫描
(MRM)
。 在母离子扫描中，第二级质谱选择特征的碎片离子，扫描检测第一级质
谱中能产生该碎片的所有母离子， 主要用于酰基肉碱的分析检测，经
CAD
后可产生相同的
碎片离子
(m/z 85)
；
在中性丢失扫描中，
两级质谱分析监测那些产生相同中性碎片的母离子，主要用于氨基酸的分析检测，
大多数氨基酸可以产生
102u
的中性碎片，
也有少数例外
(
甘氨
酸
56u
、精氨酸
161u
、鸟氨酸
119u
等
)
。因此，氨基酸分析一般采用中性丢失扫描，而在酰< br>基肉碱的分析中，
多采用母离子扫描。
新生儿疾病筛查串联质谱分析所需的试剂：
标准试剂。
Set A
：稳定同位素标记氨基酸对照品混合物，冻干粉，
1
管，
12
种
/
管；
Set B
：稳定同位素
标记乙 酰肉碱对照品混合物，冻干粉，
1
管，
8
种
/
管。标准溶液 的配制、稀释和保存：浓缩
储备液

—

用
1
mL
溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液；浓缩工作液

—

将
1
mL
浓缩
储备液（
Set A
与
Set B
）混匀，密封保存在
4
℃。为保证溶液的活性，建议 分装，
1
个月后
丢弃。日常工作液

—

取浓缩工 作液，稀释
100
倍，密封保存在
4
℃。为保证溶液的




9.1

最适新生儿疾病筛查平台

9.1.1


API 2000
?、
API 3000
?、
API 3200
?系列任一台或多台质谱仪。

9.1.2

ChemoView
?新生儿疾病筛查软件



符合
GLP
和其他相关的标准；

●


可控制不同厂商的
LC
泵和自动进样；

●


支持实时处理数据；

●


可用于其他疾病标记物的筛查；

●


从
MRM
、母离子扫描、中性丢失扫描数据自动生成浓度、离子强度或浓度比的定制报
告