邢台市人民医院国自然标书模板

2021年2月19日发(作者：中分化鳞癌)

国自然标书模板










项目
申报学科
科学部
C
C030303

国家自然科学基金


申

请

书


项目名称：
MSC
对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究



申

请

者：
















所在单位：














邮政编码：

















410016

通讯地址：











重庆市渝中区医学院路１号


电




话：














4

传




真：












6

申请日期：















2000
年
12
月



国

家

自

然

科

学

基

金

委

员

会



一九九七年制


填

报

说

明






一、
填写申请书前，
请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办
法 及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明
确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要 同时用原文和中文表达。第一
次出现的缩写词，须注出全称。





二、
申请书为十六开本，
复印时用
B5
复印纸，
于左侧装订成册。
第三页起各栏空格不够时，
请自行加页。
一式六份
（至少一 份为原件）
，
由所在单位审查签署意见后，
按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委
一份原件。





三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和
申报学科代码
1
由申请者填写。




四、
下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，
但可作为项
目组成员参加研究 ：





—
在读（含在职）研究生





—
已离退休的科研人员





—
申请单位的兼职科研人员





五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请
（含参加） 的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重
点项目、重大项目）
，不得超过两项。





六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。





七、
申请者可因同类项目竞争等原因，
提出不宜评议本项目的专
家 名单（姓名与单位，
3
人以内）
，密封于信封中，钉在申请书原件
封面，或另 专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部
将对此信息保密。





八、
国家自然科学基金委员会通讯地址：
北京市海淀 区花园北路
35
号东门









邮政编码：
100083





一、
简表


研

究

摘

内


容

要

和

意

主
义

中
英

－
1
－

通
过


M
S C
体
外

培

养

，


转
化

为

神

经

干

细

胞

，


进

而
基

因

转

染

，


体
内

移

植

，


诱
导

分

化

等

方

法

探

索


对
先

天

性

巨

结

肠

症

动

物

无

神

经

节

细

胞

段

进

行

神


经
支

配

重

建

的

途

径

和

效

果

。


本
研

究

的

完

成

将

采


用
细

胞

工

程

原

理

和

方

法

代

替

手

术

方

法


,

从
根

本


上
改

进

先

天

性

巨

结

肠

症

的

治

疗

及

预

后

，


丰
富

临


床
神

经

生

物

学

的

发

展

。































1.
主题词数量不多于三个；
2.
主题词之
M S C

神
经

干

细

胞



先
天

性

巨

结

肠

症





mesenchymal stem cell


/

neuronal stem cell

/


aganglionic bowel

简

表

填

写

要

求


一 、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新
发 布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术
新概念 新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写
B
，并在申请书< br>封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”
。

二、凡选择性栏目，将相应提 示符
A
、
B
等之一填入该栏的右下角。

三、部分栏目填写要求：

项目名称
——
应确切反映研究内容和范围 ，最多不超过
25
个汉字

(
包括标点符号）
。

基础研究
——
指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活 动。

应用基础研究
——
指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方 法为主要目的的研究。

申报学科
——
申请项目所属的最基础学科。如涉及多 学科可填写两个，先填为主学科。

申请金额
——
以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。

起 止年月
——
起始时间从申请的次年
1
月算起。终止时间为完成年度的

12
月。

所用实验室
——
系指研究项目将利用的实验室， 仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的
开放实验室。

所在单位名称及代 码
——
按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填
“中 科院西安光机所”或“西安光机所”
。全称中的数字，一律写中文，例
如：中国航天工业总公司 第七○一所。首次申请国家自然科学基金的单位，
尚未编入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数
—
—
指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(
合作者所在单位
)
，以
阿拉伯数字表示。

项目组主 要成员
——
指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。

研究内容和意义
——
摘要与主题词均录入软盘。





－
2
－



二、立论依据

（包括项目的研究意义、
国内外研究现状分析，
并附主要参考文献及出处）




对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，
论述项目的科学意义；

对应用基 础研究，
着重结合学科前沿、
围绕国
民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。


先天性巨结肠症（
Hirschsprung’s disease
，
HD
）是小儿外科领域内的一种常见性疾病，发
病率为
1/2000~1/5000
。对
HD
临床及基础研究
一直是小儿 外科研究的热点之一。
此疾病的发生
是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道
移行 受阻，
结肠壁肌间神经节细胞缺如，
病变结
肠痉挛收缩，
肠内容物排出受阻，
近端肠管继发
性扩张形成巨结肠，
影响儿童健康成长。
自发现
HD< br>的病因以来，
HD
的治疗主要依靠手术切除
远端无神经节细胞段，
手术 方式较多，
由于各种
术式固有缺陷，目前仍存在各种并发症，影响
－
3-1< br>－


且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有
肠道平滑肌，结缔 组织的增生等细胞外基质变
化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞
来源受限，另一方面能 否在体内改造病变肠段
的病理变化，仍需进一步研究。

近年来干细胞的基因修饰治疗 发展较快，
国
外有人发现将表达神经营养因子的神经干细胞
直接种植于受伤的脑组织中 ，能促进神经功能
的恢复。神经干细胞在受到碱性成纤维细胞因
子（
FGF-2
）和上皮细胞生长因子（
EGF
）刺激
时可分化出神经元和胶质细胞，
EG F
可维持神
经干细胞的生成，
FGF-2
对干细胞的分化起重
要作用 ；
有很多神经因子
（如血小板生长因子，
转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协
同作用。诱导分化剂维甲酸对神经干细胞也有
—

诱导分化作用
。< br>对于
HD
病变肠段不仅有神经
节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子
（
PA
）能激活纤溶酶原，水解纤维蛋 白，及细
胞外基质中的纤连蛋白
(fibronectin, Fn)
，层粘
连蛋白
（
laminin
，
Ln
）
，
基质金属蛋白 酶
（
matrix
metalloproteinase enzyme, MMP
）能分解周围
组织—细胞外基质，如将
PA
，
MMP
的cDNA
转染修饰神经干细胞将有可能对
HD
病变段的
病理变化进行改造 ，有利于神经干细胞生长，
发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长，
分化的分子机制，结合 基因工程技术，将可为
神经干细胞移植治疗成功创造条件。

鉴于神经干细胞的多向分 化潜能，在大脑，
脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发现，自
[3]

体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提
出

（此将为神经干细胞自体移 植提供一个很
好的来源）
，
以及神经干细胞目前被认为是一种
更优于成纤维细 胞的基因治疗的载体细胞
，
针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经
干细胞移植在 恢复受损大脑，脊髓神经功能上
具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法
修饰后，神经干细 胞移植有恢复
HD
病变肠段
的正常神经支配的可能。

细胞移植虽 然已被认为对于修复神经组织
是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自
胚胎，这样一方面细 胞来源有限，另一方面存
在异体免疫排斥作用。神经干细胞可以在体外
大量增殖，但目前主要在 海马和室管膜下层发
现有神经干细胞分布，这样造成了神经干细胞
[5]
[4]

来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细
胞和间充质干细胞（
mesench ymal stem cell,
MSC
）
。
前者的移植已成功用于临床治 疗白血病，
但其移植需要获得足够数量的造血干细胞，并
且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC
易于从
骨髓中分离，体外扩增简单，长期培养过程中
能保持多向分化潜能。
近期美国学者
Woodbury
等在体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨
髓
MSC
转化为神经干细胞
,
并进而分化为神经
元
[6]
。此研究结果很好地解决了神经干细胞来
源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多种
神经系统疾病打下了基础。

总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通
过
M SC
转化为神经干细胞恢复小儿外科常见
疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法

具有重要现实性及可能性。

美国
?
时代
?
周刊曾 将人类胚胎干细胞（
ES
细胞）和胚胎生殖细胞（
EG

细胞）建系 研究
成功列为
20
世纪末世界十大科技成就之首，
并认为
ES
细胞和人类基因组将同时成为新世
纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人
们对
ES
细胞，骨髓干细胞，神经干细胞定向
分化的研究。
将
MSC
,< br>神经干细胞定向分化，
移
植的研究引入到
HD
这一小儿外科常见病的治
疗研究中，探索
MSC
，神经干细胞克隆、定向
分化、移植对于
HD
治疗方法，可为发育生物
学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方
法，通过
MSC
，神经干细胞移植重建
HD
病变
段的正常神经支配方法的研究成功，在 临床上
将可以让
HD
患儿免于手术，使
HD
的治疗发
生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的
健康成长做出巨大贡献，并能带动本地区整个
小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在
国内及国际上的地位，为祖国西部大开发战略
的顺 利进行贡献力量。

参考文献

(1)

陈雷玲，胡廷泽， 朗诗明，等。
320
例先
天性巨结肠症的诊断与治疗分析。
华西医科
大学学报，
2000
，
31(2)
：
274-27
(2)

Kathryn
S.
Embryonic
stem
cells used
to
remyelinate
injured
rat
spinal
cord
neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890
(3)

McCaffery
P,
Drager
UC.
Regulation
of
retinioc
acid
signaling
in
the
embryonic
nervous
system:
a
master
differentiation
factor.
Cytokine
Growth
Factor
Rev.
2000,
11(3): 233-249

(4)

Natarajan
D,
Grigoriou
M,
Marcos-Gutierrez
CV
,
et
al.
Multipotential
progenitors
of
themammalian
enteric
nervous
system
capable
of
colonizing
aganglionic
bowel
in
organ
culture.
Development, 1999,126:157-168
(5)

刘平，卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。
中华神经外科杂志。
2000
，
16
（
3
）
：
196-198
(6)

Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et
al.
Ault
rat
and
human
bone
marrow
stromal
cells
differentiate
into
neurons.
J
Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370


—
3-3
—

三、研究方案

1.

研究目标、研究内容和拟解决的关键问题


研究目标：




探索建立针对先天性巨结肠症的
MSC
，
神
经 干细胞移植治疗方法。

研究内容：

１．

MSC
的分离，体外克隆；

２．

MSC
向神经干细胞的转化；

３．

多种人工修饰条件下的神经干细胞在
HD
动物模型（
lethal spotted rat, ls/ls
）无
神经节细胞肠段移植，定向分化；

４．

鉴定神经干细胞移植后
HD
动物模型
的消化道神经系统形态及机能。

拟解决的关键问题：

１．

MSC
向神经干细胞的转化；


２．

神经干细胞的基因修饰；



－
4
－



2.

拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及
可行性分析

１．

无血清培养，单细胞克隆技术；

２．

mRNA
差异消减显示技术；

３．

原位杂交；
RT-PCR
，免疫组化技术，
透射电镜技术；

４．

基因转染技术。

研究方法：

技术路线：

























建立
HD
动物模
型































MSC
的分离
及体外培养


MSC
向神经干细胞的转化







神经干细胞体外培养，克隆（
V-MYC
，
EGF
等多种 基因转染，修饰）



－
5-1
－

实验方案：

第一部分：建立
HD
动物大鼠

参< br>照
文
献
进
行
大
鼠
选
育
，< br>源
于
Wistar-Imamichi
AR
系，
HD
大鼠均
结肠造瘘处理。


第二部分：
MSC
分离培养，向神经干细
胞转化

1.

MSC
分离培养



切取鼠一侧 股骨，
暴露骨髓腔，用注射器抽取细胞培养
液（
DMEM/20
?
F BS
）
，反复多次冲
洗出骨髓细胞，用吸管反复抽吸后，
Ficoll 分离液离心分离出有核细细
胞，
移入
T-75
培养瓶，
过夜培养 ，
第
二日将悬浮细胞移去（贴壁细胞为较
纯的基质干细胞）
，
3-4
天更换培养液，
—
5-2

当
细
胞
融合
时
用
胰
岛
素
/EDTA
（
tryp sin/EDTA
）处理，收获贴壁细
胞为
MSC
(
MSC鉴定选用
CD29
，
CD90
，
CD106
等标记)
。

2.

M
SC
向神经干细胞转化



参照文献
在
MSC
培养液中加入脊索中胚层浸
出液，脊索中胚层条件培养液，星形
胶质 细胞上清液，多种神经生长因子
等。

3.

鉴
定



A.
光镜及电镜下观察转化细
胞形态改变。

B.
免疫组化或流式细胞仪检测
细
胞
转
化
后的
表
面
标
志
:
nestin,
波形蛋白，
RC
抗原。


第三部分：神经干细胞分离提取，体外培
养，基因转染

1.

神经干细胞的分离和传代




分别
取鼠纹状体和孕鼠皮层组织，吸管吹

打机械分离制成单细胞悬液，利用
DMEM/F12(1:1)
加
B27< br>及
bFGF
无
血清培养基进行原代培养，具体参见
文献。

2.

体
外基因转染





对于以上两种来
源的神经干细胞采用脂质体介导基因
转染技术，将
V-MYC
，
EGF
，及
FGF-2
，
PA
，
MMP cDNA
重组逆转
录病毒载体导入神经干 细胞，包括双
基因及单基因转染的多种形式。逆转
录病毒载体
pLNCXE
由 中国医学科
学院分子生物学国家重点实验室提
供。
E.
coli
质 粒
DNA
大量制备、纯
化和酶切参照
Sambrook
等的文献方< br>法进行；按
Lipofectamine
TM
试剂盒

说明进行转染实验。


第四部分：
神经干细胞在无神经节细胞段
的移植，定向分化及检测

1.

神经干细胞在
HD
动物模型体内移植



按多种组合形式，利用毛细显微注射
器将经多种形式基因转染的神经干
细胞 注射到
HD
无神经节细胞段；参
考文献报道进行，将注射细胞浓度定
为
0.5-1 cell/ 0.5ul
。

2.

移植后的神经干细胞在
HD
动物体内
的分化诱导




维甲酸等分化诱导
剂处理，药物浓度选择参考文献。

3.

移植后的神经干细胞对
HD
动物模型
无神经节细胞段 肠神经系统的影响
—
5-3