IVF实验室精液处理

2021年2月18日发(作者：防风的功效)
IVF
实验室精液操作规程


精液样本采集


患者取出精液后，直接交给相关实验室人员，不得由第三人转送。实验室人员应做到：

1.

询问患者夫妻双方姓名并与精液杯上双方姓名核对。

2.

检查精液杯中是否有精液样本，样本是否外泄，颜色是否异常，容器是否破损， 容
器内是否有明显异物等。如发生异常，应立即询问患者，并采取相应处理措施（如：重
新取精 ）
。


上游法分离优选精子

一、精液处理前的准备工作：


1
．将精液处理液（
HT F/G-IVF
）分装至
5ml
试管内，每份精液样本使用
2
支小管 ，分
别分装
1.5 ml
（
A
管）和
2.5 ml
（
B
管）培养液
,
放入培养箱预热平衡过。

2
．耗材：巴斯德吸管，
5ml
试管，载玻片，盖玻片，橡胶吸头，无菌镊子。

一、
正常精液
：密度≧
20x10
6
/ml
，活力
a+
b
≥
30%
的精液样本

1.


将精液置于室温
15-20min
液化。

2.


将混匀的精液取
1
滴滴于清洁载玻片上于生物显微 镜下观察并纪录精液密度、形态、
活力等相关数据。

3.

精液的收集：
在巴斯德吸管和含
1.5ml
培养液的试管
（
A< br>管）
上填好相应的姓名标签，
并在其后的每一步操作之前核对姓名。吸取
1.5 ml
精液加入试管中与培养液
1:1
充分混
合，如液化不全可多次吹吸至混匀 ，
500g
离心
10min
。

4.


精液的洗涤：吸弃上清，用一支新的巴斯德吸管从含
2.5ml
培养液的试管中（B
管）
吸取
1.5ml
液体加入含精液沉淀的管中。吹吸重悬精液沉淀，
400g
离心
8min
。

5.

上游：吸弃上清，将试管
B
中剩余的
1ml
培养液吸出，沿含精液沉淀的 试管
A
管壁
缓慢加入。两管均贴好标签，将试管
A
倾斜
45
°角放于培养箱中静置
30min
。

6.

< br>分离优质精子：上游结束后，用巴斯德吸管将试管
A
中的上游液小心吸出，转入试
管
B
中混匀，取一滴滴于一载玻片上，压片镜检。报告上游液中精子密度、活力和形态
等相关数据，将分离好的精子置于培养箱中待用。

7.


分离 结束后关闭超净台，整理并丢弃相应污物。精液沉淀须保存至移植日，精液杯
盖好后置于物品台上，待当 日受精结束后丢弃。


二、
轻度少弱精
：密度
5x10
6
/ml
至
20x10
6
/ml
之间，活力
a+b:<30%



处理方法与正常精液处理基本一致，但注意在精液收集步骤可采用多管 同时收集，并在
上游时依据精液情况减少上游培养液的使用。


三、
重度少弱精
：密度＜
5x10
6
/ml
< br>上游之前的步骤与轻度
少弱精的精液
处理一致，
上游时仅加少量的培养液。如果上游结
束之后分离的上游液中未见精子，则将精液沉淀中加入
0.2ml
培养 液混匀使用。




1
四
、逆向射精精液
：注意精液取出后应立即处理，
1:1
加入
E arle
’
s
缓冲液中和精液。基
本处理方法与少弱精处理方法一致。


密度梯度离心法分离优选精子

原理：
Percoll
密度梯度离心法是以二氧化硅胶体外包裹以聚乙烯吡咯烷酮为介质，具有分

离活动精子的作用。目前多采用两层不连续
Percoll
密度梯度离心法。


一、精液处理前的准备工作：

所需的耗材：巴斯德吸管，
5ml
及
50ml
试管，载玻片、盖玻片，无菌橡胶吸头及镊子


1.
提前一天准备好精液处理液，每个患者约
4ml,
放于培养箱中预热平 衡过夜。

2.
分别配制浓度为
90%
和
45%
的密度梯度离心液（以
SpermGrad
（
VITROLIFE
）为例，采
用精液处理液稀释）

3.
在精液处理前吸取
1.5ml
浓度为
90%
的密度梯度离心液加于
5ml
试管底部，再将同体积
浓 度为
45%
的密度梯度离心液轻轻置于其上，试管中可见明显的界面分层。


二、精液的分离优选：

1.
核对取精杯上患者姓名等相关信息并在其后的每一步操作之前核对姓名。

2.
将精液置于室温
15-20min
液化

3.
将混匀的精 液取
1
滴滴于清洁载玻片上于生物显微镜下观察并纪录精液密度、形态、活
力等相关数 据。

4.
用巴斯德管吸取液化的精液
1-1.5ml
置于配制好的梯度液上，
500 g
离心
15min
。

5.
用巴斯德吸管吸弃离心管上部 的精浆和密度梯度液，将底部的精子沉淀转移至新的含有
2ml
精液处理液的试管中，
400g
离心
8min
。

6.
用巴斯德吸管吸上清弃去 ，加精液处理液
0.5-1ml
，轻轻吹散精子沉淀，制成精子混悬液
备用。同时滴取 制备好的精子混悬液于载玻片上，观察并纪录优选后的精子相关数据。

7.
关闭超净台，整理并丢弃相应废液污物。


附睾睾丸穿刺所得精子的处理

所需的耗材：
35mm
圆皿，
1ml
注射器，巴斯德吸管，
5ml
试管，载玻片、盖玻片

提前一天准备精液处理液，每个患者约
3ml,
放于培养箱中预热平衡过夜。


（一）
PESA
（附睾穿刺取精术）样本

1.
取一滴附睾穿刺液滴于载玻片，压片后镜检，观察是精子数量、活力、形态，若有活动
精子，则将附睾 穿刺液收集于浴盆中（含
2ml
精液处理液的小圆皿）
，做好标记，置于培养
箱中进行短暂培养，待行
ICSI
前取出进行处理。若全片均无可用精子，则通知医生进行另< br>一侧附睾穿刺或行睾丸穿刺。

2.
行
ICSI
前，从培养 箱中取出浴盆，用巴斯德吸管将浴盆中的所有液体混匀后吸至干净的
5ml
试管中，
3 00g
离心
10min
，吸弃上清，另用一个巴斯德吸管吸取少量干净培养液，滴加< br>10
滴于试管内备用



2
（二）
TESA
（睾丸穿刺取精术）样本

1.
将穿刺 取出的睾丸组织置于浴盆中，标记姓名，取两支一次性
1ml
注射器，在体视镜下
将睾 丸组织撕碎。

2.
于倒置显微镜下镜检，先在
10
×
2 0
倍镜下观察有无精子，是否易找，有无活动精子。再
与
10
×
40
倍镜下观察并纪录精子形态。

若全皿均无精子则应通知医生进行另一侧睾丸穿
刺，报告无精子时应有两人以上共同确认。

3.
若有精子，则置于培养箱中进行短暂培养，其后操作步骤同
PESA
。

选择受精方式

常规授精：

经诊断因女方因素不孕而男方精液正常 者且继往无污染等异常
IVF
助孕史的患
者选择常规受精。

经优选 后达到常规受精的最低标准为优质精子数
20-30
条
/HPF
，密度
80-140
万
/ml
。


单精子注射：
所有单精子注射的选择应以取卵日患者的精液情况为最终标准。

1.

少弱畸精子症
:
1)

重度少精症：即精液中精子密度≤
5x10
6
/ml
。

2)

少弱精症：即精液中精子密度为
5x10
6
/ml
至
20x10
6
/ml
之间，前向运动精子
<30%
或精子活动率
< 40%
。

3)

弱精症：即精液中精子密度
>20x10
6
/ml,
精子活动率
< 5%
。

4)

畸精症：目前对于 畸精症是否作为明确的
ICSI
指征尚有争议。出于安全性考虑，
在临床治疗应慎重选 择
ICSI
，避免过度使用，对精子有微小异常和畸形的夫妇不
应采用
ICS I
作为常规治疗方案。对于完全不活动或者顶体缺乏（圆头）的精子，
必须采用
ICS I
的方式受精。完全不活动的精子可以通过低渗等途径挑选存活精子
进行单精子注射。

除了原始的精液数据外，在
IVF
治疗中采用何种授精方式也要着重参考精液处理后所
获得的总活动精子数。在考虑是否采用
ICSI
受精时要结合精液密度、活力、形态和 相关功
能检查及女方生育史，
IVF
史等因素综合考虑，尽量严格把握
ICS I
指征，如果能够采用常
规
IVF
方式，不应该扩大
ICSI
指征。

2
．既往
IVF
受精失败史或
IVF
低受精率史

(
正常受精率
<20%)
常规
IVF
受精失败的原因有多 种，为了预防再次发生受精失败，在新的治疗周期中倾
向采用
ICSI
受精。
但是
ICSI
替代常规
IVF
不一定能避免受精失败或低受精率的发生．在确
定新的方案时应详细分析前一次失败原因。

3
．不明原因不孕

不明原因不孕的患者，如果多次
IUI
未孕，在改行
IVF
方案治疗时如果获卵数≧
12
，
可采用
RT
和
ICSI
受精各半的方式。

4
．梗阻性无精子症

5
．生精功能障碍

6
．
IVM
7
．解冻卵母细胞

8
．解冻精子活力弱


9
．污染史

10
．免疫性不孕

综上所述，考虑到
ICSI
安全性和潜 在风险，在临床治疗中应当严格保守的选用
ICSI
方
案，
除了参考精液原始 的密度、
活力或形态的参数外，
还要结合精液处理后获得的总活动精

3