为什么要放弃治疗鼠尾草黄酮对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2021年2月13日发(作者：北京安贞医院预约挂号)
鼠尾草黄酮对
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶抑制作 用的研究


Behvar Asghari
a,b*
, Peyman Salehi
b
, Ali Sonboli
c
, Samad Nejad Ebrahimi
b,d


摘要
人们认为抑制碳水化合物水解酶的活性，包括
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶，是降低餐后
血糖水平的治疗方法之一，
特别是治疗
2
型 糖尿病患者。
药用植物及其他们提取物是找到新
的酶抑制剂的主要来源之一。
我们从鼠 尾草的地上部分分离得到四种黄酮类化合物
,
即木犀
草素
-7-O-
葡萄糖苷
(1)
，木犀草素
-7-O-
葡萄糖苷酸
(2)
，香叶木素
-7-O-
葡萄糖苷酸
(3)
和三裂
鼠尾草素
( 4)
。通过
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶的抑酶试 验对这些化合物的活性进行了评估。
化合物
1
、
2
和
3表现出明显的
α
-
葡萄糖苷酶的抑制作用，其
IC
50
值分别为
18.3
，
14.7
，


17.1μM
。
这些化合物也表现出适度的的
α
-
淀粉酶的抑制作用，
其
IC
50
值分别为
81.7
，
61.5
，
和
76.3μM
。

关键词：鼠尾草；
α
-
淀粉酶 ；
α
-
葡萄糖苷酶；酶抑制作用；黄酮类化合物


前言

糖尿病是全球新兴的一个健康问题。
最近调查评估说明了一个严峻的现 实
,
到
2050
年将
有三分之一的人口患有糖尿病
(1)< br>。
1
型糖尿病
(
胰岛素依赖型
)
和
2
型糖尿病
(
非胰岛素依赖型
)
是糖尿病主要的两种类型。全世
90 %
的糖尿病患者属于
2
型糖尿病患者，主要是因体重增
加和缺乏锻炼导致的。 已有研究表明，
2
型糖尿病表现为餐后血糖水平异常升高。因此，控
制餐后血糖水平是 治疗
2
型糖尿病的一个重要因素，
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶是催化复杂碳
水化合物糖苷键断裂的关键酶，
如催化淀粉糖苷键断裂释放 可吸收的葡萄糖。
α
-
淀粉酶是胰
腺分泌的主要产物之一，
约占5 - 6%
，
它催化淀粉水解为较短的寡糖
(3)
。
α
-
淀粉酶的蛋白质
结构包含
3
个结构域：
A
，
B
和
C
。催化三联体
(Asp
197
，
Glu
233
和
Asp
300
)
位于结构域
A
。淀粉的水解过程就是一个双取代反应过程，酸催化形成
β
-D-
吡葡亚硝脲
-
酶中间复合物，接着
碱催化水解中间复合物。
Asp
197
作为亲 核中心进攻位于糖异头物中心的底物，

Glu
233
和
Asp300
起到酸催化或碱催化的作用，
要么单独作用要么两者协同作用
(4)
。
α
-
葡萄糖苷酶是催化非还
原性末端以
1,4-
糖苷键 链接的葡萄糖残基释放出游离的葡萄糖分子。研究表明氨基酸残基
Trp
516
和Asp
518
是酶催化功能的关键
(5)
。
抑制
α-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶的活性可以延缓葡萄
糖的释放，有效控制餐后血糖水平。
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶 抑制剂目前已有临床应用，
如
阿卡波糖和米格列醇，
会产生严重的副作用。
越 来越多的报道揭露了这些制剂的抗药性
(6)
。
为了克服这些问题，寻找新的
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶抑制剂，特别是从天然产物来源中寻找有效的抑制剂正在进行着且被推崇
(7)
。

鼠尾草是世界遍布最广 的唇形科植物，
包含
900
多个物种，
特别是在温带和较暖的地区
( 8)
。在伊朗，鼠尾草有
58
个种，其中有
17
个物种是地方性的< br>(9)
。鼠尾草精油及其提取物
具有多种生物活性，包括抗氧化，抗菌，抗真菌，抗肿瘤 ，抗炎，抗胆碱酯酶，抗原生动物
和抗糖尿病

(8
，
10)
。在伊朗的民间，鼠尾草有用于治疗糖尿病

(11)
。也有报道关于鼠尾草
有抑制
α
-
淀粉酶和
α-
葡萄糖苷酶的作用。研究表明
ulosa
的不同提取物具有抑制
α-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶的作用。其中，总酚含量高的甲醇提取物对两 种酶均有很好的抑制
作用
(12)
。
从
aftiama
的丙 酮粗提物中分离得到的
5-hydroxy-7,4-dimethoxyflavone
和< br>齐墩果酸是两种有效
α
-
葡萄糖苷酶抑制剂

(13)
。
Ma
等对
rrhiza
的酶抑制作用进行了
评估，并从
75%
的乙醇提取物中分离得到
16
种活性化合物

(14)
。在另一项研究
Nickavar
Abolhasani
的报道中谈到，
从
Salvia virgata的醇提物中分离出的黄酮，
金圣草素对
α
-
淀粉酶
具有良好的抑 制效果

(15)
。有人研究了伊朗当地植物
leuca
精油的化学 成分及抗菌
活性
(16)
。
本文报道了
lueca
提取物对
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶活性的影响以及通过
生物测定引导分馏过程分离和鉴定其有效成分。首次对
lueca
的化学成分及其对
α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖苷酶抑制能力进行了研究。


实验

试剂

猪胰腺
α
-
淀粉酶

VI
型
(EC 3.2.1.1)
，面包酵母
α
-
葡萄糖苷酶
I
型

(EC 3.2.1.20)
。
3,5-
二
硝基水杨酸
(D NS)
，
p-
硝基苯
-
α
-D-
葡萄糖苷
(PNPG)
，麦芽糖和阿卡波糖
(Sigma- Aldrich
，巴
黎，法国

)
。可溶性淀粉、磷酸二氢钠
(NaH2PO4)
、酒石酸钾钠和氯化钠
(
默克公司
)
。分析< br>级萃取溶剂和高效液相色谱级溶剂

(
巴塞罗那，
西班牙
)< br>。
液相色谱级水：
EASY-pure II
水净
化系统
(Barnstead, Dubuque IA, USA)
。氘溶剂
(Armar
化学品，
Dottingen
，瑞士
)。


仪器





分析 型高效液相色谱分离系统：
1100
系列组成的二元高压混合泵与脱气器模块、柱温
箱 和
1100
系列
PDA
探测器
(
安捷伦，
Wald bronn
，
德国
)
。
吉尔松
215
液体处理器，
吉尔松

819
注入模块和
50μL
自动进样环。高效液相 色谱
-
质谱联用系统：
3000 +
离子阱质谱仪，电喷射
(ESI) (
Bruker Daltonics
，
Bremen
，德国
)
。使用
HyStar 3.0
执行数据采集和处理软件
(
Bruker
Daltonics
)
。半制备高效液相色谱分离系统：安捷伦

1 100
系列四元低压混合泵和脱气器模
块
,
柱温箱，
1100
系列
PDA
探测器和
1000μL
自动进样环。制备型高效液相色谱系统：

SCL-10VP
控制器和二进制泵
(LC-8A)
，紫外可见< br>SPD-M10A
VP
探测器和
Class-VP
6.12
软
件
(
日本岛津公司
)
。
Avance III
光谱仪：
500 MHz
1
H
和
125 MHz
13
C (Bruker Biospin
，
Fallanden，
瑞士
)
。
1
毫米
TXI
探针，数据处理：< br>Topspin
2.1(Bruker)
。抑酶试验的混合物吸光度测定：
酶 标仪（
BioTek
）
。


植物原料

leuca
的地上部分，
原料于
2008
年
6
月采摘于从海 拔
2300
米的
Shahrestanak
（位
于伊朗的德黑兰市）
。植物学博士
Dr.
Ali
Sonboli
（药用植物与药物研究所生物系，
Shahid
Beheshti University
，德黑兰，伊朗）对原料植物做出生物学鉴定。凭证标本
(MPH 845)
放置
在药用植物与药物研究所，
Shahid Beheshti University
，德黑兰，伊朗。


提取和分离

取干燥的叶子
100g
，用
ZM 1
超速离心粉碎机（
Retsch
，
Haan
，

德国
）粉碎后过直径
为
0.75mm
的筛网，连续用正己烷，乙酸乙酯，甲醇 浸提，溶剂用量各为
2L
。提取液减压
浓缩至干燥状态，
得到了
20 g
的甲醇提取物。
将甲醇提取物用蒸馏水溶解制成悬浮液，
加到
Diaion HP-20(5×
40 cm)
层析柱中。用水洗脱后，再用
3 L
甲醇洗脱，收集到一小部分富含酚
类化合物的片段
（
8.1 g
）
。
这一部分再过
sephadex LH-20 (2×
50 cm)
层析柱，
用甲醇洗脱。
TLC
法鉴别合并相似组分
,
最终产生了
5
个片段
(F1-F5)
。这
5
个片段都做了< br>α
-
淀粉酶和
α
-
葡萄糖
苷酶的抑制实验。
活性最强的片段通过制备型高效液相色谱分离纯化，
色谱柱：
SunFire C
18
，
5 μm
，
150 ×
30 mm
，
Waters
；
流动相：
10-100 %
的甲醇，
0.1 %
的乙酸水；
流速：
20 mL/min
；
时间：
40 min
；进样量：
200 μL
。收集得到的峰再经半
制备型高效液相色谱分离纯化，
色
谱柱：
SunFi re C
18
，
5
μm
，
150 ×
10 mm
，
Waters
；流动相：
10-100 %
的甲醇，
0.1 %
的
乙酸水；
流速：
4 mL/min
；
时间：
40 min
。
从
F3
中得到化合物
1 (8 mg)
，
化合物
2 (5 mg)
，
从
F4
中得到化合物
3 (6 mg)
。正己烷提取物通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为正 己
烷
-
乙酸乙酯混合物。收集到的
40%
乙酸乙酯洗脱部分
(250 mg)
经半制备
高效液相色谱分
离纯化，最终产生了已知的化合物
4
，即三裂鼠尾草素
20 mg
。四种化合物的具体分离纯化
过程用流程图表示，见图
1
。


木犀草素
-7-O-
葡萄糖苷
(1)
1H NMR (500 MHz, DMSO-
d6) δ 3.16
-3.46 (m, sugar-H), 3.69(d, J = 11.0 Hz, H-
5″), 5.02 (d,
J = 7.4 Hz, H-
1″), 6.41 (d, J = 2.0 Hz, H
-6), 6.67 (s, H-3), 6.74 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.87 (d, J =
8.3 Hz, H-
5′), 7.37
-7.40 (m, H-
2′,6′). UV λmax 254 nm, 350
nm. MS (m/z) 447.1 [M-H]-.

木犀草素
-7-O-
葡萄糖甘酸
(2)
1H NMR (500 MHz, DMSO-
d6) δ 3.28
-3.51 (m, sugar-H), 3.98 (d, J = 9.3 Hz, H-
5″), 5.23 (d, J
= 7.2 Hz, H-
1″), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, H
-6), 6.70 (s, H-3), 6.79 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.91 (d, J = 8.5
Hz, H-
5′), 7.40
-7.45 (br s, H-
2′, 6′). UV λmax 254 nm, 350 nm. MS (m/z) 461.1 [M
-H]-.

香叶木素
-7-O-
葡萄糖苷酸
(3)
1H NMR (500 MHz, DMSO-
d6) δ 3.33
-3.45 (m, sugar-H), 3.90 (s, OMe-
4′), 4.02 (d, J = 9.6 Hz,
H-
5″), 5.25 (d, J = 7.3 Hz, H
-
1″), 6.47 (d, J = 2.0 Hz, H
-6), 6.86 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.93 (s, H-3),
6.95 (d, J = 8.3 Hz, H-
5′), 7.55
-7.40 (m, H-
2′, 6′). UV λmax 268 nm, 345 nm. MS (m/z) 475.1
[M-H]-.

三裂鼠尾草素
(4)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.89 (s, OMe
-
4′), 3.92 (s, OMe
-7), 3.96 (s, OMe-6), 6.54 (s,
H-8), 6.58 (s, H-3), 7.02 (d, J = 9.0 Hz, H-
3′, 5′), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, H
-
2′, 6′). UV λmax 274 nm,
330 nm. MS (m/z) 329.1 [M+H]+.