超临界流体 抗溶剂作用

2021年2月7日发(作者：睾丸图)

超临界流体辅助雾化技术制备溶菌酶纳米粒过程中的抗溶剂作用


摘要
：在高压二氧化碳或氮气（压力在８—２５
MPa
之间）作用下利用雾化过程从水乙醇溶液中制备粒径在
0.1
—
-5
微米之间的溶菌酶微粒的过程 与超临界辅
助雾化过程类似。
利用这两种超临界流体都可以制得完美的纳米级微球。
利 用氮
气制得的微粒在所有的试验条件下都是球状，
而利用二氧化碳制得的微粒在不同
的 预混合条件下明显分为两种形态。
本文展示了由于混合液预膨胀相平衡条件的
不同，
利 用二氧化碳辅助雾化技术制备微粒的过程明显分为两种机制：
抗溶剂结
晶和喷雾干燥结晶。这两种机制会分别得到纤维状或球状的微粒。
溶菌酶的活性
仅仅取决于抗溶剂过程，而利用 氮气制备过程中溶菌酶的活性基本都能恢复。

关键词
：

辅助雾化，微粒，纳米球，抗溶剂，溶菌酶，超临界流体

1

导言

因为其良好的物理化学性质，粒径分布较窄的微粒被广泛应用于生物化学，材料学，
医药品和化妆品等多个领域。
因此最近就有了很多关于微粒的制备的研
究 课题和出版物。

一些在研磨，结晶，喷雾干燥等传统方法中很难或者不能制得微粒的物质，< br>在利用超临界辅助技术的情况下变得可能。
特别是某些具有热敏性，
结构不稳定
性或有生物活性的物质，
比如蛋白质。
在本文中，
辅助雾化过程与以下过程有关，即通过与气态或超临界态流体共同减压以增加液体喷射分散性的过程。
以上所说
的液体一般 是药物溶液（溶剂是水或选定的有机溶剂）
，减压过程可以通过不同
的方式加以控制。

在文献中提到的利用超临界二氧化碳来辅助液体溶液的喷雾过程主要有三
种：
SEDS
，
超临界流体快速分散溶液技术，
在同轴条件下超临界二氧化碳辅助液
体溶解 进高压抗溶剂中；
CAN
—
BD
，二氧化碳辅助雾化及泡式干燥，超临界二氧
化碳在喷嘴前的Ｔ型混合釜中被迅速混合；
SAA
，超临界辅助雾化技术，液体溶液在分散前在填料塔中被二氧化碳饱和。
后两种方法的相似之处在于溶液被喷射
进一个近似 于大气环境的容器中，
在这里溶剂被氮气流干燥。
考虑到沉淀的机制
（
SED S
中为超临界二氧化碳抗溶剂干燥，在
SAA
和
CAN
—
B D
中为氮气流的喷雾
干燥）不同，有报道说其对某些医药品比如抗生素，疫苗，激素的控释进程 有影
响。
然而，
在关于辅助雾化过程条件是如何影响蛋白质的完整性和稳定性方面的< br>

信息还很少。

CAN
—
BD
和
SAA
是气体（或超临界流体）辅助雾化过程的典型例子，因为平
常使用的液体
/< br>气体质量流量比过高，
不会有任何抗溶剂沉淀出来
（通常都在
0.1
以 上）。但是，如果气体流量增加
10
倍会怎么样？在如此剧烈的雾化作用下产
生的粒子 的性质会怎么样？或者，
在辅助流体含量如此高，
混合条件很容易受到
影响导致抗溶剂 在喷嘴前发生沉淀会怎么样？喷嘴前混合的两种流体
（液体溶液
和辅助流体）
过多所产 生的抗溶剂效应使得溶质沉淀，
而涉及这种条件下液体溶
液的辅助雾化过程的信息几乎没有。< br>
Li
等人的研究已经为雾化过程中的两个阶段（在
PGSS
过程中） 建立了某种
趋势，以证明在单一的降压步骤中可能有不同的反应机制存在。

尽管当液 体溶液被压缩二氧化碳混合的时候可能会有抗溶剂效应发生，
但在
以超临界流体（
SC F
）技术为基础的蛋白质微粒制备过程中，雾化仍然是主要的
反应机制。

对 于液体溶液中含有较高含量的有机溶剂
（比如乙醇）
，
或是同轴喷嘴带有
预膨 胀釜，特别是在高压条件下的时候喷嘴之前的混合物的初始态不应被忽视。
据
Li
等人 的研究，混合物初始态的不同，会导致沉淀过程中起主要作用的机制
分为抗溶剂沉淀和雾化液滴干燥两种 。机制的不同意味着微粒形成的途径不同，
所得产品的性质也有所不同。
特别是形态差异很大— —雾化过程会得到无定形态
或纤维状微粒
（取决于系统的表面张力等性质）
；
而抗溶剂沉淀过程会得到晶体
状微粒。同一作者表明，液体混合减压前，即混合物初始态的相平衡条件， 决定
了氢化棕榈油微粒的形态。
例如，
雾化过程混合物在气液两相中易得到球形微粒，
而结晶过程混合物在
SCF
中易得到纤维状微粒。

乙醇作为助溶剂 已经被广泛的应用于高压二氧化碳溶于水的系统，
并且乙醇
的使用有利于提高微粒制备过程的效 率。
然而，
由于没有深入的相平衡知识，
准
确的描述混合流体的初始态和正确 的理解混合物微粒的形成机制是很困难的。
根
据其他的报道，
对二氧化碳
/< br>水
/
乙醇系统的相平衡进行了研究和进一步调查，
包
括高压汽液平衡和 体积膨胀现象对微粒的形成（或蛋白质的干燥）很重要。据
Badilla
等人所定义，
液体摩尔体积的相对膨胀是每个溶剂
/
抗溶剂体系的特征，
并且是混合物溶解能力的 很好的表征。

最近，
Wang
等人研究了喷嘴前混合条件的不同对用水/
乙醇溶液制备牛血清
白蛋白微粒的影响。
他们报道说，
制得的牛血清白 蛋白球形微粒直径在
3
微米以


下的时候没有发现蛋白质的生物活 性的重大损失。
然而，
液体溶液流速是影响蛋
白质活性的最显著的因素，较低的液体溶 液流速易导致牛血清白蛋白的变性。

我们选择溶菌酶为模型蛋白，
因为在过去的十年 中，
在使用
GAS
，
SEDS
，
ARES
，
以及
CAN
—
BD
技术研究超临界流体制备微粒过程中，溶菌酶得到了深入 的研究。
根据所使用的方法和操作条件的不同，普遍都能得到粒径在
0.1
微米到20
微米
的溶菌酶微粒，
呈凝聚状态或分散状态，
盘状，
针状，
或其他不规则形状。
然而，
尽管在这方面做了深入的研究，决定蛋白质性质的工艺条件 仍不清楚。

氮气的低相容性和极不明显的抗溶剂作用使其成为一个良好的评估二氧化
碳抗溶剂性能的试剂。最近
Zhao
等人描述说，利用二氧化碳辅助雾化过程得到
了球 形，
不规则形态和标准差较大的呈凝聚状的多种形态的微粒；
而氮气辅助雾
化过程所得 的微粒形态变化不大，
这是由于氮气的惰性性质，
使其对实验条件的
变化不敏感所致。

在工作中，
我们重点研究了超临界流体抗溶剂效应对于制备溶菌酶微粒的影
响，
即分别使用氮气和二氧化碳两种流体，
而溶菌酶微粒是溶液在带有预膨胀混
合釜的 同轴喷嘴处减压所得。
预膨胀混合釜的作用就在于使得两种流体可以在设
定的温度和压力条件下 ，
以及由辅助流体的高流速产生的强烈的剪切力作用下实
现混合。
在沉淀釜中干燥溶剂 时气体
（或超临界流体）
在高流速条件下抗溶剂效
应的影响得以显现，
而在中 流速条件下作用不明显，
使用
CAN
—
BD
和
SAA
技术所
得的结果一致。

2
实验

2.1
溶菌酶溶液的配制

溶菌酶，购自美国
Roche
，溶解在蒸馏水中 得到质量浓度为
1
％至
8
％不等
的溶液。此溶液再用无水乙醇（Riedel
—
de Haen
）稀释，或溶菌酶直接溶解在
水和乙醇的混合液中，然后其组成由称重确定。

2.2
过程描述



微粒制备流程由图表一所示。

液体溶液在一个小的混合釜中与高压气体或超临界流体 混合，
经由一个同轴
喷嘴由泵（由
TSP
的计量泵，型号
2396- 74
）压至压力为大气压的沉淀釜中进行
减压。图
1
（
b
） 给出了喷嘴的近距离细节图，其尺寸与
SEDS
技术中常用的典型
喷嘴相类似。气体由
Newport
压缩机（型号
46-13421-2
）进行压缩。喷嘴流量< br>由质量流量计（
Rheonik
，模型
RHM007
）测量，压力由压 力传感器（
Omega
，型


号
PX603
）< br>测量。
气室和水浴的温度通过
T
型热电偶和
Ero
电子控制器
（型号
LDS
）
控制。泵停止后，向沉淀釜中通入中流速的干燥气体（氮气或 二氧化碳）将剩余
的溶剂压出。制得的微粒在沉淀釜出口处被一个过滤器收集。一个孔径为
15 0
微米的喷嘴被用于氮气的实验中，而二氧化碳实验中使用的是
50
微米或
1 00
微
米的喷嘴。
二氧化碳实验中选用较小直径的喷嘴以限制其流量并且防止喷嘴因强
烈的减压过程而冻结。

2.3
颗粒表征

使用电子显微镜（
SEM
）
Hitachi
S2400
对 溶菌酶粒子的形态进行扫描分析。
在测量之前，微粒样本在真空环境中在电流的作用下包被了一层金属薄 膜。

使用电镜对微粒样本进行扫描，扫描时间由
TSI
公司的
Aerosizer LD
进行
测定，然后用
Sigma Scan
软件进行分析即可得微粒样本的粒度分布。

溶菌酶的活性是利用可以对悬浊 液的浊度进行连续读数的分光光度计进行
测定的。
冻干细菌悬浊在由磷酸缓冲液调节的
PH7.0
的等渗溶液中，
直到悬浊液
在
450 nm
处的吸光度范 围在
0.700
——
0.850
之间。溶菌酶微粒以
1.0
毫克
/
毫
升的浓度溶解到上述等渗缓冲液中，
然后以
1:250的比例进行稀释。
每次测量温
度为（298.1
±
0.1）
K,
将
50
微升的溶菌酶溶液加入到
2.95
毫升的细菌悬浊液中进行测量。用分光光度计（
Hitachi
U
—
2000
型 ，日本）在
450nm
处测量液体
5
分钟后的吸光度下降值。
由采用铜元素的
BrukerD8
改进型的
XRD
设备在
Bra gg
Brentano
几何体中进
行
X
射线衍射分析。扫描压力为
40
千伏和电流为
30
毫安。角度（
2
θ
）以2°
/
分钟的速度从
5
°变化到
60°。

2.4
相平衡的计算

气相密度和液体的摩尔体积可以由
Sty jek
—
Vera
修改式或
Peng
—
Robinson< br>状态方程和
Panagiotopoulos - Reid
的混合规则计算而得。这里 所使用的参数
取自以前的工作，通过对采集和测量所得的实验数据进行拟合而得。

液 体摩尔体积膨胀量可由
Badilla
等人建立的公式（
1
）计算而得。
（
1
）


在式（
1
）中，
V
是摩尔体积，
T
，
P
和
x
1
分别是温 度，压力和
CO
2
的液相组
成。下标
0
表示体积是在参考压 力（大气压）下计算而得。