谷胱甘肽化学与酶法合成

2021年2月7日发(作者：加特纳菌)

谷胱甘肽化学法和酶法合成

1
化学性质

谷 胱甘肽（
glutathione
，
GSH
）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸 结合而成
的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为
G-SH
）分 子式
为
C
10
H
17
N
3
O
6< br>S
，分子量为
307.32348
，熔点为
189~19
3< br>℃，晶体呈无色透明细长
拉状，等电点为
5.93
。
GSH
有 还原型（
G-SH
）和氧化型（
G-S-S-G
）两种形式，
在生理 条件下以还原型
GSH
占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。
该酶的辅酶为 磷酸糖旁路代谢提供的
NADPH
。


图
1

GSH
的结构式

2
药理作用

GSH
可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、
解毒、灭活激素等功能。

3
谷胱甘肽的生产方法





18 88
年，
GSH
首先从酵母中分离出来。
日本
1983
年进 行了含量较多的
GSH
酵母的生产，其后又研究了
GSH
提取、分离技术及分 析检测方法。目前国外实
现了
GSH
规模生产。世界主要的氨基酸制造商
Ky owa
，
Aji-nomoto
和
Degussa
等都相继投巨资于 氨基酸的研究与开发，仅
Kyowa 1998
年氨基酸的研究与开发
就耗费达
1.9
亿美元，
而
GSH
是其重点之一，
Kyowa
目前 是
GSH
主要的供应商。
目前
GSH
的主要生产方法有：萃取法、发 酵法、酶法和化学合成法。

3.1
萃取法

萃取法主要是通过萃取 和沉淀的方法从
GSH
含量比较高的动植物组织中将
GSH
分离提取的一种方 法，
GSH
的早期生产都是采用萃取法，
是生产
GSH
的经
典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：



图
2 GSH
发酵法工艺路线图

该方法的不足：由于
GS H
在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和
收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。< br>
3.2
酶法

在酶催化合成
GSH
中，几种关键的 化合物和条件包括：
GS
H
Ⅰ和
GS
H
Ⅱ、
氨基酸 原料
(L-
谷氨酸、甘氨酸和
L-
半胱氨酸
)
、
A TP
、保持
GS
H
Ⅰ和
GSH
Ⅱ活性
所必需的辅因 子
(Mg2+)
和一个适当的
pH
值环境。合成中，需求大量
ATP
，给
GSH
的工业化生产带来麻烦，大大提高了
GSH
生物合成的成 本，所以只能寻求
一个
ATP
生成系统来藕联
ATP
消耗系统。两种 系统同在一种生物体内的称为自
藕联系统，
在多种生物体内的称为共藕联系统。
自藕联 系统研究的比较少，
因为
很难找到一种生物体同时含有
ATP
生成系统和ATP
消耗系统。

Murata
等人发现酒酵解菌
(
s
.cerevisae)
中的葡萄糖是最简单的
ATP
生产系统
之 一，可以提供足量的
ATP
用来
GSH
的生物合成。酶催化法合成
G SH
的浓度
可以达到
99/l
，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了
GSH
生物合成的成本。

3.3
发酵法

生物发酵法是 利用廉价的糖作为原料，
利用微生物体内物质的代谢途径来合
成
GSH
的方法 。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工
艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法 已成为目前
GSH
工业化生产的最普遍
方法。
在工业上，
生物发酵法 一般都选用
s
.eerevisae
和

Candidautilis
为原料进行
发酵。

一般情况下，微生 物细胞中
GSH
含量不高，仅为细胞干重的
0.1~1.0%
。过
高 含量的
GSH
容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，
GSH
是胞内产物，实 际
生产过程中需要进行提取，
较低的含量无疑会大大提高生产成本。
因此，
发 酵法
生产
GSH
的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的
GSH
含量。
二者的有
机结合将有利于
GSH
产量的大幅度提高。


发酵法己成为目前生产
GSH
的最通用的方法。
但也存在着生产菌 株中
GSH
含量较低，提取困难，成本造价高、产率不稳定等问题。

3.4
化学合成法

化学合成法生产
GSH
始于七十年代，
是将< br>L-Glu
、
L-Cys
和
Gly
经过一系列
化学反 应缩合成
GSH
，大体上是经过基团保护，缩合，脱保护，三个阶段。目
前化学合成法 生产工艺比较成熟。
但是化学合成方法比较复杂，
反应步骤多、
反
应时间长、 成本高、操作复杂、可能会发生消旋而影响活性、环境污染等多种不
利因素，所以有关
GSH< br>的化学合成研究不如生物合成那么广泛。而且由于经济
利益的因素，很多有关化学合成
G SH
的专利和期刊都没有公开报道。

3.5
化学
-
酶法合成

化学
-
酶法合成，即先用化学方 法合成
S-
苄基甘氨酰半胱氨酸，再与谷氨酸
在生物催化酶谷氨酰转肽酶的作用下生成
GSH
。


S-
苄基
-
谷胱甘肽的产率 受到酶纯度的严重影响，而该酶的分离纯化工作量
非常大，成本高。应用谷胱甘肽转肽酶催化合成
S-
苄基
-
谷胱甘肽，需要通过基
因工程手段提高谷氨酰转肽酶的酶活和转 肽反应的选择性。

4 GSH
的化学
-
酶法合成可行性分析

化学
-
酶法合成
GSH
步骤：①

用
Bz l
对半胱氨酸的巯基进行保护；②用
Z
保护基对半胱氨酸的氨基进行保护；
③ 活化半胱氨酸的羧基；
④采用成酯的方式
对甘氨酸的羧基进行保护；⑤保护后的半胱氨酸和甘氨 酸反应；⑥反应后产物
SBCGM
与
L-
谷胱酰胺在酶的作用下发生反应，生 成
L-
谷胱酰
SBCGM
；

合成路线如下：



图
3

化学
-
酶法合成
GSH
路线图

由上述合成路线可 知，进行
GSH
的化学
-
酶法合成需要克服以下几点：

首先，γ
-
谷胱甘肽转肽酶（γ
-GTP
）的来源问题：

一是考虑市售商品，γ
-GTP
价格昂贵，
8839
元
/1 000u
，成本过高，不适于
生产需要；

二是考虑使用菌株生产实验室生产 ，考虑诱导合适的高产菌株耗时比较长，
难度很大，故需购买产γ
-GTP
的菌株，见 表
1
，例如枯草芽孢杆菌
NX-2
，不过
该类菌株属专利保护菌种， 价格比较昂贵；同时，酶的纯化相对复杂，如何得到
高纯度以及高活性的酶是试验的重点和难点。

表
1

γ
-
谷胱甘肽转肽酶生产菌

菌种

地衣芽孢杆菌
A35
γ
-
谷胱甘肽转肽酶（生成量，
U/mL
）

3.020