丰都县中医院胶原蛋白提取及氨基酸序列

2021年2月6日发(作者：注射瘦脸针多少钱)
管圆线虫胶原蛋白基因的测序与表达


生命科学学院
08
级
3
班
09080319
吴星星

一．胶原蛋白介绍

胶原蛋白又名胶原质
,
是由动物细胞合成的一种生物性高分子
,
是构成动物结缔组织的主要蛋白

质
,
广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中
,
在脊椎动物中 约占总蛋白的
1/3
。最常见的
3
种胶
原是
Ⅰ
型 、
Ⅱ
型、
Ⅲ
型胶原
,
其中
Ⅰ
型胶原是成 年动物皮中的主要胶原形式。胶原蛋白中脯氨酸和羟
脯氨酸的含量是各种蛋白质中含量最高的
[ 1]
。蛋白质是一切生命体必不可少的组成部分
,
胶原作为一
大类蛋白质
,
在生物体内起着重要作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质
,
使这类生物高分子化合物

用途非常广泛
,
遍及医药、化工、食品 等领域
[2]
。胶原蛋白具有巨大的开发潜力和利用价值。随着科
学技术的发展
,
人们对胶原的应用越来越广泛
,
对胶原蛋白的需求越来越大
,
如何既经济又快速获得
胶原蛋白已成为人们关注的课题。

<
一
>
实验材料介绍

广州管圆线虫病
( Angiostrongyliasis)
是由广州管圆线虫
( Angiostrongylus cantonensis)
幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。人感染广州管圆线虫后
,
幼虫在人体内移行
,
侵犯中枢神经系统
,
引起脑组织病变。患者 出现嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。临
床症状主要为急性剧烈头痛
;
其次为恶心、呕吐、发热及颈项强直
;
严重病例可有瘫痪、嗜
睡、昏迷
,
甚至死亡作为一种新发传染病的病原
,
广州管圆线虫的许多生物学特性
,
特别是
分子生物学方面
,
还未被人们所认知。
鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼
虫
,
本实验根据广州管圆线虫幼虫的
cDNA
文库表达序列标签
( expression sequence tag,
EST)
测序结果
,
采用
PCR
技术克隆并鉴定了广州管圆线虫胶原蛋白
( collagen, COL)
基因
的全长
cDNA
序列
,
并构建了其原核表达重组质粒
,
为下一步的深入研究奠定了基础。

二．胶原蛋白的提取

1.1
实验原料

广州光源线虫

1.2
仪器设备

Beckman LG10 - 2.4A
冷冻离心机
; Unico UV-2102
紫外分光光度计
; ALPH AL- 2
冻干
机
; DYY-
Ⅲ

电泳仪
:;
自动定氮仪
:KTJELTEC, Auto1030 Analyzer; 835- 50
型氨基酸分析
仪
:; WR- 2001
溶剂过滤器
:


1.3
试剂材料

胃蛋白酶、胰酶
:,
三氯乙酸
,
对二甲氨基苯甲醛
,
氯氨
T,
高氯酸
,
巯基乙醇
,
柠檬酸缓冲液
等。所有试剂均为分析纯
;
超滤膜
: TS- 100, CXA- 50,
实验方法

1.4.1
酶法提取胶原蛋白本实验选用胰酶、
胃蛋白酶进行酶解
,
提取管园线虫的胶 原蛋白。
按
原料∶缓冲液
(pH8~9)1
∶
3
匀浆
,
加入胰酶搅拌均匀
,
在
45
℃酶解
4h,
沸水浴灭酶
10min,5000r/min
离心
15min,
取上清液
,
将上清液冷冻干燥保存。去脂去杂蛋白的线虫
,
按
原料∶缓冲液
(pH2)1
∶
7
匀浆
,
加入胃蛋白酶搅拌均匀
,
在
37
℃酶解
6h,
沸水浴灭酶
10min,
7000r/min
离心
15min,
取上清液
,
将上清液冷冻干燥保存。

补充：酶法提取胶原蛋白具体原理

胶原蛋白是由三股螺旋组成的
,
分子量在
30
万
u,
每条肽链的分子量大约为
10
万
u
。因胶原蛋
白酶对胶原蛋白的水解主要破坏胶原的螺旋区
,
使胶原蛋白水解为小分子肽类及游离氨基
酸
,
而其他蛋白酶对胶原蛋白的酶解促溶
,
只是切除胶原蛋白的尾肽
,
使其变为可溶
[4],
所以
用胃蛋白酶促溶的胶原蛋白溶液
,
同原胶原具有相同的形状、
大小及氨基酸组成
,
同酸溶性胶
原蛋白在性质上无显著不同
[5],
胃蛋白酶水解胶原蛋白是在
37
℃
,
胶原蛋白没有变性
[6],
从
图
1
第
4
泳道的谱带可确定所提出的胶原蛋白为天然的、未变性的大分子胶原蛋白。


胃蛋白酶提出的胶原蛋白粗品分子量在
7.8
×
104
～
9.9< br>×
104u
范围内
,
如图
1
所示
,
说
明样品的结构保持了肽链的完整性。然而
,
当胃蛋白酶提取物被截留值为
10
万的超滤膜分
离之后
,
样品却被分解
,
形成了小分子量片段
,
反而破坏了胃蛋白酶提取 的胶原蛋白的结
构。
从被分离的两组分样品的分子量测定结果可以看出胃蛋白酶提取物无法被超 滤膜完全分
离。这可能因为胃蛋白酶提取物的冻干粉溶解于
pH2
的缓冲液中
,
形成了十分黏稠的液体
,
无法穿透超滤膜
,
不利于超滤
;
并且胃蛋白酶提取的胶原蛋白粗品从电泳图谱来看分子量相
差不大
,
因此
,
用胃蛋白酶提取的胶原蛋白不需再进一步分离。根据电泳结果
, < br>胰酶提取得
到的胶原蛋白样品分子量分布在
3.2
×
104
～
5.1
×
104 u
之间
,
说明胰酶的水解力较强
,
已经
把胶原蛋白水解为小分子片段。分别用截留值为
10
万和
5
万的超滤膜进行分离
,
不同组分
收集到的产物用
SDS- PAGE
电泳测得的分子量结果相近
,
都在
2
～
3
万
u
之间。

三．胶原蛋白中氨基酸组成及含量

氨基酸组成分析

表
2
胶原蛋白中氨基酸组成及含量

氨基酸名称


Sigma
标准蛋白

胶原蛋白
(
胰酶提

胶原蛋白
(
胃酶提

含量
/%aa
个数

取
)
含量
/%aa
个数

取
)
含量
/%aa
个数

Asp
Thr
Ser
Glu
Pro
Gly
Ala
Val
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Lys
His
Arg
Hyp
合计

3.61 4.78 7.39 6.25 6.28 5.43
1.25 1.66 1.94 1.84 1.88 1.82
1.2 2.01 2.32 2.48 2.48 2.72
6.74 9.06 12.39 9.65 11.51 9.00
9.01 13.78 15.11 14.78 16.28 16.30
11.14 26.10 19.76 29.63 16.41 24.73
5.97 11.80 8.84 11.17 9.53 12.30
1.87 2.80 3.36 3.23 3.24 3.18
0.54 0.64 1.18 0.85 1.01 0.78
0.93 1.24 1.93 1.66 1.40 1.22
2.04 2.73 3.53 3.02 3.51 3.07
0.17 0.16 1.48 0.92 0.73 0.47
1.42 1.51 2.68 1.82 2.51 1.74
2.43 2.92 3.85 2.97 4.26 3.35
0.46 0.52 1.33 0.96 0.89 0.66
4.80 4.84 3.17 2.02 8.73 5.76
6.45 8.66 8.49 6.78 8.51 7.47
60.03 100 98.72 100 98.89 100
用酶法提取出的胶原蛋白其氨基酸组成和含量与
Sigma
胶原蛋白标准品比较
,
结果如
表
2
所示。对表
2
的数据进行分析可以看出
,
在用胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中
,
甘
氨酸的含量分别
19.76
和
16.41%,
而
sigma
胶原蛋白标准品中甘氨酸的含量是
11.14%
。胶原蛋
白
I
是由两条
α
1(I)
和一条
α
2
组合而成的三股螺旋
,
一级结构表明
,
α
肽链的
96%
都是按
三联体的重复顺序
(Gly- x- y)n
排列而成的
, Gly
数目占残基总数的
1/3[1]
。
表
2
的数据显示
,
胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中每
100
个氨基酸中
Gly
的残基数分别为
29.63
和
24.73
个
,
而
Sigma
胶原蛋白标准品中甘氨酸的残基数为
26.10
个。
Sigma
胶原蛋白标准品中氨基
酸的总量仅占
60.03% ,
其余为一些盐类杂质
,
这从
SDS- PAGE
的电泳图谱中也得到了验证
,
但在它的蛋白组成中
,
胶原蛋白的含量占
95%,
达到了较高的纯度。本实验用胰酶和胃蛋白
酶提取出的胶原蛋白中
,
蛋白含量分别为
98.72%
和
98.89%,
蛋白含量都高于
sigma
胶原蛋
白标准品
,
但纯度略低
,
分别为
81%
和
84%
。
若经过适当的纯化处理
,
可提高其纯度。
如本实
验中用胰酶提取的胶原蛋白用截留值为
5
万 的超滤膜分离
,
在滤过组分的蛋白中胶原蛋白的
含量
87%
。

四
．胶原蛋白全长
cDNA
的克隆及
PCR
扩增

1.
材料

1.1
文库广州管圆线虫幼虫的
cDNA
文库由本室用
CLONTECH
的
SMARTTM cDNA
文库构
建试剂盒构建
,
文库的初始滴度为
2.19
×
106 pfu /ml[ 3]
。

1.2
菌株与质粒大肠埃希菌
( Escherichia coli, )DH5
α
株和
BL21
株、原核表达质粒
pET32a ( +)
为本室保存
; pMD18- T
载体购于大连宝生物工程有限公司。

1.3
主要试剂限制性内切酶为
MBI
公司产品
; T4DNA
连接酶、
Taq DNA
聚合酶、
dNTP
为
大连宝生物工程有限公司产品
;
琼脂糖、
胰蛋白胨和酵母提取物为英国
Oxoid
公司产品
;
其余
试剂为国产分析纯。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
PCR
反应引物由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成。

2.
方法

2.1 EST
分析通过
NCBI
数据库
( http: / / /BLAST/ ) Blastn, Blastx