头孢他啶皮试胶原蛋白酶的研究进展

2021年2月6日发(作者：苯中毒症状)
胶原蛋白酶的研究进展
三亿文库

设为首页

收藏本站

首页考试资料幻灯片工程技术公务员考试小学教学中学教学大学教学外语资料

36
胶原蛋白酶的研究进展

胶原蛋白酶的研究进展；摘要：胶原蛋白特有的 三股螺旋结构使其难于被人体吸；关键
词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素；
Abstrac t:Thenutritionala
；
Keywords:collagenproteas
；胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是；加
［
4
］［
1
－
3
］和生物活性等特性，被愈来愈多的；
[5-6]
抗疲劳等 生理调节功能的小肽，是
极具发展

胶原蛋白酶的研究进展

摘要：

胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多 肽
后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了
胶原 蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。

关键词：胶原蛋白酶，

作用机理，影响因素

Abstract: The nutritional and physiological function of collagen protein can be significantly
improved via chemical or enzymatichydrolysis
，
as the collagen protein was difficult to be
absorbed by human body due to the triple helical characteristic molecules structure. Collagen
protease is a kind of high value of protease. In this paper, introduces the definition of collagen
enzyme, selection, influence factors, mechanism etc. The future development direction it was also
prospected.
Key words: collagen protease, mechanism, influence factors
胶原蛋白是人体 内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的
功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫 原性、生物相容性、生物降解性

加［
4
］［
1
－
3
］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广
泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增。天然胶原蛋白经蛋白
酶水解后，可 得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、

[5-6]
抗疲劳等生理 调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界
最热门的研究课题之一。

胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳
定的性 质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率
较低
[7]< br>。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收
率几乎达
100
％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节
炎等胶原病 具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等
[8]
。寻
找一 种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。

1
胶原蛋白酶的定义和选择

1.1
定义

胶原蛋白酶
(Collgaenolytci protease)
定义为在适当的
pH
和温度下，只切割活性胶原螺旋区
或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类

1.2
酶的选择

能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内 切酶和外切酶；从来源上可分为
植物蛋白酶
(
如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等
)
、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、
微生物蛋白酶
(
如枯草杆菌1.398
、放线菌
166
等
)
；此外，较常用于水解的蛋白 酶还有风味
复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强
度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶
原水解率，而 酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚
远。因此开发的产品如没有特殊 要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之

1


外 ，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决
定能否得到目标产 物的一个关键因素

[12-13][9-10]
。

。细菌胶原酶 可分泌到胞外，通过发酵可大量获得，微
[11]
生物来源的胶原
酶在应用方面具有更 广的应用范围。

2
胶原蛋白酶的水解特性和作用机理的研究

2.1
胶原蛋白酶的水解特性

对于水解胶原蛋白方面的研究，国外的报道很多。例如
Ruud A. Bank
等采用
SDS-PAGE
决
策法分别测定
α
-
胰 凝乳蛋白酶水解完整的胶原蛋白、热处理（
70
℃，
30min
）过的变性的
胶原蛋白、以及用人体胶原酶解旋的胶原蛋白得到的碎片的尺寸，通过比较得出胰凝乳蛋
白酶不 能使完整的三股螺旋的胶原蛋白分子解链，但能使变性的胶原蛋白完全降解成小分
子产物

在
37
℃经过
12h
能够水解不能溶解的牛胶原蛋白
[15][14]
。。

研究发现美洲比
目鱼胶原蛋白酶不能水解牛胶原蛋白，鱼胶原蛋白酶在
pH
为
7
时活性最高。天然的鱼胶
原蛋白酶。
Masato Hiyama
等人实验发现某种曲霉菌丝氨酸蛋白酶
OK-22
，在
37< br>℃，
pH
为
7.5
，经过
48h
，Ⅰ
-型胶原蛋白的水解程度达到
12
％。曲霉菌丝氨酸蛋白酶水解Ⅰ
-
型胶原
蛋白的上限大约是
12
％，与水解乳酪的程度一样，而真菌蛋白酶水解胶原蛋白的程度 要比
水解乳酪的程度弱的多
[16]
。
Siriporn Damrongsakkul
等在用木瓜蛋白酶和应用
Neutrase
蛋
白酶水解生牛皮时，发现应用
Neutrase
蛋白酶水解的产物中，胶 原蛋白的水解产物的粘度
跟水一样低。Ⅰ
-
型的人类胶原蛋白是存在于哺乳动物体内最 丰富的一种分子，天然的胶原
对大多数的胶原蛋白酶都具有抵抗力
[17]
。
J. Friedrich
等在研究角蛋白酶对天然胶原的水解
能力时发现羽毛角蛋白和胶原不能被

[18]
这种从菌类提取的角蛋白酶水酶。

曾名勇等采用正交试验确定了菠萝蛋白酶和
alcalase 2.4L
碱性蛋白酶 这两种酶单独水解鱼
皮胶原蛋白的最佳酶解条件。在此基础上，进行复合酶水解实验，表明先采用菠萝蛋 白酶
水解，再用
alcalase
2.4L
蛋白酶水解，效果更佳
[19]
。薛勇等在研究岩藻聚糖硫酸酯寡糖
-Ce(
Ⅳ
)
配合物的 制备
及其对胶原蛋

[20]
白的水解活性时发现小分子岩藻聚糖硫酸酯寡糖
-Ce(
Ⅳ
)
的配合效果最好，且水解胶原
蛋白的活性高，并通过实 验确定了配合条件以及配合物对胶原蛋白的最佳水解条件。孙爱
梅等研究认为胰蛋白酶对
天然胶原蛋白几乎没有作用，但可以降解变性的胶原蛋白。胰蛋白酶水解胶原的最适条件
是
pH
为

8.1
～
8.2
、温度
37
℃

。在此条 件下，采用凝胶过滤色谱分析考察了酶用量时间对胶原蛋白
降解过程的影响。通常情况下，在酶促

反应中底物浓度比酶浓度高得多，增加酶用量对酶促反应初始速率影响较大，而且速率增
加 与酶用量成正比，随着底物浓度的降低，酶用量对反应速率的影响逐渐减小

件为，并对胶原水解产物的理化性质进行了测定

2.2
胶原蛋白酶的作用机理

对于酶作用机理的研究也很多。
Misook Ki m
等利用从生姜的根茎中提取的半胱氨酸蛋白酶
GP2
水解从小牛皮中提取的Ⅰ
-
型胶原蛋白时，发现这种酶能作用于胶原分子三条螺旋链上
的相同位点，是目前唯一被证明 能够水解天然胶原的植物半胱氨酸蛋白酶
[23][22][21]
。陈
秀金等研究了 用碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解产物时，影响胶原蛋白水解产物收
获率的各种因素，确定了最佳 水解条。

。
Yoshio Yamakawa
等测定了纯出血蛇毒素水解几
种白明胶和胶原蛋白的能力。但在天然胶原中只有Ⅳ
-
型胶原能够被水解。出血蛇毒素 对
Ⅳ
-
型胶原的水解具有时间依赖性，在开始的
2 h
水解非常迅速 ；出血蛇毒素作用于Ⅳ
-
型胶
原不同的位点来水解三股螺旋结构
[24]。
Magda Gioia
等检测了嗜中性粒细胞胶原蛋白酶，
白明胶酶
A
降解胶原纤维的作用机制，通过研究Ⅰ
-
型胶原蛋白在
37
℃时水 解，确定了在

2
处理过程中两种
α
-
链胶原蛋白的功能 差异。运用热力学和动力学参数定量的比较，发现金
属胶原蛋白酶对对胶原蛋白分子链的解旋和伸展至少 有两种截然不同的机理
[25]
。
A.
Cristina Sarmento
等认为存在三种溶胶机理，一种是用裂缝胶原蛋白酶，

[26]< br>能够分裂稳定三股螺旋胶原蛋白，第二种是拓宽的精细蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶，
能够作用于天 然胶原蛋白分子的分裂的肽端，第三种是细菌蛋白酶及组织蛋白酶。
Eric
Dufour
等研究了胶原酶和组

织蛋白酶
B
水解Ⅲ-
型的胶原时流体静压力的作用。实验证明高压条件下胶原分子表面一些
氨基酸侧链不宜暴 露，也不宜被组织蛋白酶
B
识别。胶原水解的速率随着压力的增大而减
小。高压会导致 酶和底物的构象发生变化，压力还会改变酶的弹性

[27]
。

3
影响酶活力的因素

酶也是一种蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，都可能使酶失去 活性，如物理因素（温
度、压力、光、磁场），化学因素（氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、< br>pH
）和生
物学因素（酶修饰和酶降解）蛋白酶在加工和贮存期间活力都会降低，在常温 （
25
℃，湿
度
25%
）下，贮存一个月酶活力降低达
20
％～
30%
，蛋白酶的易失活特性极大地限制了其
生产和应用。蛋白酶的活性 降低主要是由于蛋白酶的巯基易被氧化，与
SO2
的相互转化，
形成了醌
-< br>硫醇复合物，并可自行降解。

3.1
化学因素

3.1.1
有机溶剂

一般情况下，随着有机溶剂浓度的增大，蛋白酶活力 呈直线下降。试验证明，当甲醇、乙
醇、乙二醇浓度分别达到
25.5%
、
2 0.5%
、
24.0%
时，酶活力丧失一半，浓度达到
50%
时，< br>酶活力完全丧失。在十二烷基硫酸钠（
SDS
）变性中，菠萝蛋白酶活力随
SD S
浓度的增大
而呈指数下降，而
α
-
螺旋度开始有所下降，然后出现 回升趋势，
SDS
达
4mg/ml
时，酶完
全失活，而
α< br>-
螺旋度增加
24%[28-30]
。潘江球等研究报道，聚丙烯酰胺（
PAAM
）可使蛋
白酶在
30
、
45
、
50、
60
℃下贮存后，酶活力保留率分别提高
l3.8%
、
22. 9%
、
25.2%
、
28.4%
。贮存温度越高，
PAAM
提高酶活力保留率的效果越明显，
PAAM
在液体酶中同样
可以显著地提高酶 的稳定性。这是因为
PAAM
是一种高分子亲核试剂，通过氢键固定在酶
的表面来稳定 酶分子构象；它对蛋白酶分子还起到一种包埋作用，有效地防止巯基的氧化
失活；也由于它从酶相互作用 区域排除水，降低自由能，使酶的贮存稳定性得到了显著的
提

高

3.1.2
金属离子

在
pH7.0
时，草酸钠对蛋白酶 有明显稳定作用，
100mmol/L
草酸钠能使酶活半衰期延长
6
倍，丁二 酸钠、酒石酸甲钠对酶活也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠对蛋
白酶都有一定程度的保护 作用，并且浓度变化对保护作用的影响不大。研究证明，添加苯
甲酸钠，贮存
1
个月后 酶活力比对照组提高
14
％。添加焦亚硫酸钠，在
15
℃下避光保存
2
个月酶活力保持不变。
Ca2 +
和
Zn2 +
对蛋白酶有一定程 度的保护作用。
KCl
和
NaCl
对蛋白
酶热稳定性基本没有影响< br>[32][31]
。

；
CaCl2
和
MgCl2< br>在一定浓度下显现出一定的保护作
用，分别比对照品提高了
21%
和
1 2.4%
。
Zn
（
Ac)2
和
ZnCl2
在低浓度 下就可增进酶的热稳
定性，在合适的浓度下，酶活力分别比对照品提高了
32.4%
和
29.1%
。在这些金属离子
中，发现对蛋白酶有一定作用的都是二价离子，以锌离子 的作用较为明显，钙、镁离子次
之。而对于锌离子，醋酸锌的功效显得更大些，它能以极低的浓度（5×
10-4mol/L
）获得显
著的稳定效果。

3.1.3
共溶剂

糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇（PEG
）等一般被
称为蛋白质的共溶剂。对某一活性酶来说，其酶失活半衰期是常数，因此 可以菠萝蛋白酶
失活半衰期用作衡量酶热稳定性的指标。研究证明，
40
％半乳糖对菠 萝蛋白酶有一定的保
护作用，能使其酶活半衰期提高
3
倍；
50
％葡 萄糖可将菠萝蛋白酶的半衰期延长
10
倍，但

3
有研究指出，葡 聚糖和肌醇对该蛋白酶没有保护作用。蔗糖、麦芽糖、棉子糖和松三糖等
寡糖对菠萝蛋白酶均有明显的保 护作用。也有人证明，低浓度的蔗糖、葡萄糖、
β
-
环糊
精、黄原胶对提高酶 的热稳定性没有作用。
50
％甘油可将菠萝蛋白酶的半衰期延长
8
倍，
乙二醇和甘露醇对菠萝蛋白酶有一定的保护作用

甘露醇即使在低浓度下也能促进酶溶液的热稳定性。

近几年的研究表明，共溶剂对酶 的保护作用机制是共溶剂的加入改变了溶液的热力学性
质，使酶的稳定性得到增强，理论上称优先排阻作 用。共溶剂从酶表面的优先排阻并不是
说共溶剂分子绝对不能渗透到酶表面并与之结合，而是在酶表面完 全水化和共溶剂完全结
合之间建立起一种平衡。糖类是酶蛋白在溶液中和在干燥状态下较好的稳定剂。甘 油和多
元醇对酶的非极性表面有

很好的稳定作用。另外，一些研究者发现，混合使用共溶剂可大大提高酶的稳定效果。

[33]
。试验还证明，多元醇甘油、

3.2
物理因素

3.2.1
温度和湿度

一般动物蛋白酶的最适反应温度介于
37
～
40
℃，植物蛋白酶的最适为
50
～
60
℃，温 度升
高，酶的热失活增强，反应速度下降。

在干燥环境下，蛋白酶活力相对稳定，但随着环境湿度的增大，酶失活速率加快

3.2.2
光照

光对蛋白酶活性的影响是明显的。试验证明，将菠萝蛋白 酶进行避光和无避光贮存
10d
后，无避光下酶活力的保留率比避光下降低了
9.8%
。这是因为蛋白酶中的巯基、氨基、色
氨酸残基和唯一的组氨酸残基是酶活性的必需基团，日光 对这些基团的破坏性很强，日光
中的紫外线等可以引起酶构象的改变或使酶的氨基酸残基氧化、引起共价 键断裂等反应

3.3
生物因素

Lee
等报道，用脂质 膜微胶囊包埋保护蛋白酶，能有效地提高蛋白酶的稳定性
[36]
。据黄惠
华等报道， 以聚乙二醇为分散剂和稳定剂，用氧化低价铁盐的方法制成具有磁性响应性的
微球，用
1.33 %
浓度的该磁性微球吸附分离的蛋白酶，回收率达
61.96%
，酶活性为
3 .8
万
单位
/g
，固定化磁性蛋白酶的热稳定性有显著提高，常温下的保存半 衰期为
28d
左右
[37][35][34]
。

。

。用琥珀酸酐法活化后的聚乙二醇（
PEG
）修饰蛋白酶，所得 到的修饰酶
在对温度和
pH
值的稳定性上均比天然酶有一定程度的提高。这说明
PEG
分子对酶有一定
的保护作用，推测这种作用应来自分子间的作用力。
Mg2+
和
Ca2+
对修饰酶有不同程度的
激活作用，而
Na+
对修 饰酶无明显影响
[38]
。以脱乙酰甲壳质为载体，戊二醛为交联剂，
对蛋白酶进行固 定化，研究其对啤酒澄清的作用。采用右旋糖醛对蛋白酶进行化学修饰，
经修饰的酶能较好地保持蛋白酶 活性，并且具有更好的稳定性。

4
胶原蛋白酶的提取方法

蛋白 酶的提取方法有很多种：沉淀法、层析法、膜超滤法，提取胶原蛋白主要用的的是层
析法。

4.1
层析法

层析法又称为色谱法。在层析分离中基于固定相和流动相中 各组份阻滞能力的作用不同，
又可分为分子筛层析、离子层析、亲和层析等。

4.1.1
分子筛层析

分子筛层析
( gel chromatography)
又称为凝胶层析或凝胶过滤。分子筛层析是利用有一定孔
径 范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术，适用
于分离和提纯蛋白 质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差
25%
的
样品，只要通 过单一凝胶床就可以完全将它们分开。具有分子筛作用的物质很多，如浮
石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、 聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等，以葡聚糖凝胶应用最广。分
子筛层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及 不影响分子生物学活性等优点，目前已被

4