关键词不能为空

当前您在: 首页 > 育儿 >

脉管炎症状肺成纤维细胞分离

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-02-05 22:15

跌打损伤怎么办-手术疤痕

2021年2月5日发(作者:宫颈癌一般能活多久)
【摘要】


目的:

建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化 和培养技术
,
用于体外研究间质性肺
病的发病机制及治疗方法。方法:

采用胰酶消化出生后
2 d SD
大鼠肺组织块及
SD
大鼠肺
泡灌洗液
,
经差时贴壁法
,
分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞
(lung fibroblast, LF)

SD
大鼠肺
泡巨噬细胞

pulmonary alveolar macrophage,AM

,
并进行原代培养。
用波形蛋白
(Vimentin)


CD14
细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果:
< br>所得细胞
产量大、纯度高。细胞免疫荧光染色
LF
细胞波形蛋白染色阳性而CD14
染色阴性;
AM

胞则相反。
扫描电镜观察可见肺成纤 维细胞有微绒毛,
细胞间连接成网状,
蛋白质印迹结果
显示波形蛋白表达。结论:
该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的
分离纯化培养技术
,
可用于间质性肺病(
interstitial
lung
disease,
ILD
)的发病机制及治疗方
法的体外研究。



【关键词】


大鼠
;


肺成纤维细胞
;


巨噬细胞
;


原代细胞培养


[基金项目]

江苏省高校自然科学研究 计划项目(
03KJD320076

;
镇江市社会发展科技计
划项 目(
SH2004043






Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats



Y
AN Yu-lan,



LIU Yang,

BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian,

ZHENG Jin-xu



(Department
of

Respiratory
Medicine,
the
Affiliated
People

s
Hospital
of
Jiangsu
University,
Zhenjiang
Jiangsu
212002;
School
of
Medicine



Jiangsu
University,
Zhenjiang
Jiangsu 212013,China)




Abstract



Objective:
To
develope
a
reliable
method
for
isolation,

purification
and
primary
culture
of
lung
fibroblast(LF)
and
pulmonary
alveolar
macrophage(AM)
from
rat
for
studies
on
pathogenesis
and
treatment
of
interstitial
lung
disease
in
vitro.
Methods


The
lung
tissue
of
2
days
old
immature
rats
was
digested
with

and
AMs
were
isolated
and
purified,

then
cultured.
The
nature
of
the
cultures
was
identified
by
CD14
staining,
vimentin
staining, electron micrography and Western blot.

Results


Excellent yields of highly purified,

culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively.
The
expression
of
CD14
in
AMs
was
positive
and
that
of
vimentin
negative
by
immunofluorescence chemistry. Those,

however, in LFs were just opposite. Ramified stracture
between
purified
LFs
were
observed
by
ultrastructural
examination
under
electron
in
in
purified
LFs
was
revealed
by
Western
blot.

Conclusion


This
technique
might
be
a
reliable
method
for
isolation
and
purification
and
primary
culture
of
pulmonary
alveolar
macrophages
and
lung
fibroblasts
from
rat
lung
and
could
be
used
for
the
study of interstitial lung disease




Key
words



lung
fibroblasts;


immature
rat;


pulmonary
alveolar
macrophage;

primary cell culture



原代培养又称初代培养
,
是自供 体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养的
细胞来源于刚刚离体的组织和细胞
,
其生物学特性未发生很大变化
,
仍具有二倍体遗传特征
,
最接近和反映体内生长特性
,
对研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化的机制具
有极其重要的价值
,
还适宜行药物干预、细胞分化等实验研究。但原代培养的组织由多种细
胞成分组成
,
分离、纯化技术难度大
,
培养条件相对要求高。红皮鼠即出生后
2

3 d
鼠,肺
组织主要由肺上皮细胞和肺成纤维细胞
(lung fibro blast,LF)
组成;
肺泡灌洗液主要为肺泡巨
噬细胞
(alveolar macroph age,AM)

因此红皮鼠肺成纤维细胞及成鼠肺泡巨噬细胞的分离、

化 和原代培养对体外研究间质性肺部疾病至关重要。本研究参照姜明等[
1
]的方法
,
成功
地分离、纯化并培养出了鼠肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞。




1

材料与方法




1.1













新生
2 d SD
红皮鼠
;DMEM
培养液
(
低糖型
, Gibco

美国
),

胎牛血清
(Gibco

美国
),

蛋白酶(
Gibco
,美国
);
培养瓶、
24
孔培养板及圆玻片
(
购于
Nuclon
公司
)
。< br>



1.2









1.2.1

培养液的配制


配制
DMEM
,再加入终浓度
100
ml/L
胎牛血清
(FCS)

100
U/ml
青霉素、
100
μ
g/ml
链霉素;

PBS
配制成
0.1%
胰蛋白酶
,
再加入终浓度
0.02%EDTA,
过滤除菌。




1.2.2

取材


将新生
2 d

SD
红皮鼠
,

75%
乙醇浸泡消毒
5 min,
窒息处死,剪开胸

,
取出肺组织浸泡于
PBS
中备用
;SD
大鼠
(250 g)
腹腔内注射
3%
戊巴比妥
0.2

0.3 ml /100g
麻醉,气管切开,置入直径
2
mm
的塑料管,用
4
℃生理盐水
5
ml
进行灌洗,每次抽洗
3
次,共
6
次灌洗,
1 500 r/min 4
℃离心
10 min
,弃上清,沉淀置
10%FCS DMEM
培养液中。




1.2.3

原代培养


将取出 的肺组织用
PBS
冲洗以洗去血液。用组织剪去除其表面的胸

,
修剪其周边,

PBS
轻轻混悬,
待组织块自然沉降后吸弃上清
,
重复
3

4
次至上清清亮
,
后剪成
1m m
×
1mm
×
1mm
大小的组织块
,

0.1%
胰酶
(37
℃预温
)
将组织块洗
1
遍< br>,
按照每
只幼鼠
1ml
加入
0.1%
胰酶
, 37
℃消化
15

20 min,

大部分组织块被消化为细胞悬液
,
加入与
消化液等量的含
10%FCS

DMEM
终止消化
,
用吸管充分吹打均匀
,1 500 r/min
离心
5 min,

弃除上清
,
较均匀地接种在
50 ml
玻璃培养瓶上
,轻轻地加入上述
DMEM
培养液约
0.5 ml,

37
℃含
5%
CO2
培养箱培养过夜后
,
次日加入
2
ml
培养液继续培养;将上述
SD
大鼠的肺< br>泡灌洗液沉淀接种在
50
ml
玻璃培养瓶中
,
采用差时贴壁 法,即先在
37
℃含
5%
CO2
培养箱
培养
2.5

3 h,PBS
洗涤未贴壁细胞,加
37

2.5 g/L
胰蛋白酶消化
10 min
,调整细胞浓度为
(1.5

2 .0)
×
106/ml,
然后移入带圆玻片
24
孔培养板上继续培养。




1.2.4

传代培养


成纤维细胞的原代细胞培养
5

7 d

,
细胞 汇合成单层。

PBS

2
遍后加
2.5 g/L37
℃胰蛋白酶消化
2 min

可见细胞连接松弛
,
此时加入等体积的含血清培养液
终止消化
,
吸管轻轻吹打使细胞脱落并混匀。
1 000 r/min,
离心
6 min
。弃上清
,
加入
2 ml
新的
培养液
,轻轻吹打混匀
,
显微镜下计数
,

(2

3)
×
107/L
接种到
25
ml
塑料瓶中
,37

,5%CO2
孵箱培养
,

3

4天换液
1
次,如细胞纯度不够,可采用差时贴壁法,
LF
贴壁速度快
,


20 min
左右
,
首先吸附在瓶壁上
,
经过
2

3
次贴壁选择后
,
贴附的是纯的
LF,
然后将第
3
代在带圆玻片的
24
孔培养板上进行培养,复孔
3
个。

跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕


跌打损伤怎么办-手术疤痕



本文更新与2021-02-05 22:15,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:http://www.xapfxb.com/yuer/442935.html

肺成纤维细胞分离的相关文章