男不育-包皮粘连
一、实验名称:质粒
DNA
的提取与纯化,
DNA
琼脂糖凝胶电泳< br>
二、实验原理:
1.
质粒
DNA
的提取:
质粒是一类存在于几乎所有细菌 等微生物中染色体之外
(细胞质中)
呈游离状态
的双链、闭环的
DNA
分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最
常用的基因克隆载体。除质粒外,大肠杆菌 中还含有基因组
DNA
、各种
RNA
、蛋
白质和脂质等物质,
因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体
DNA
等物质才能分
离纯化出质粒
DNA
。
分离制备质粒
DNA
的方法很多,
其中常用的方法有碱裂解 法、
煮沸法、
SDS
法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、
质粒分子大小、
碱基组成和结构等特点以及质粒
DNA
的用途进行选择。本实验使
用碱裂解法,
即利用
Solution
Ⅰ
、
Ⅱ、
Ⅲ三种溶液分离提取质粒
DNA.
其原理如
下。
(
1
)碱裂解法提取大肠杆菌质粒
DNA
的原理:
碱裂解法提取质粒
DNA
是根据共价闭合环状质粒
DNA
和线性染色体DNA
之间变性
与复性的差异来分离质粒
DNA
,
达到分离提纯 质粒
DNA
的目的。
在
pH
值高达
12.6
的碱性 条件下,
线性的
DNA
因氢键断裂,
双螺旋结构解开而变性,
尽管在 这样的
条件下,
共价闭环质粒
DNA
的大部分氢键会被断裂,
但超螺 旋共价闭合环状的两
条互补链相互缠绕,不会完全分离。当加入
pH4.8
乙酸钾高盐 缓冲液恢复
pH
至
中性时,
共价闭合环状的质粒
DNA
复性 ,
恢复其天然构象,
以可溶状态存在于液
相中;
而线性的染色体
DN A
由于两条互补链彼此已完全分开、
分子量大、
结构复
杂而相互缠绕形成不溶 性网状结构。与不稳定的大分子
RNA
、变形的蛋白质以及
细菌碎片等一起沉淀而被除 去。
进一步用酚、
氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,
然后用无水乙醇沉淀,即可获得 纯化的质粒
DNA
。
Solution
Ⅰ
、Ⅱ、Ⅲ三种溶
液以及无水乙醇沉淀
DNA
的具体作用和原理如下。
(
2
)四种溶液作用及原理:
①
Solution I< br>的作用:悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防
止
DNA
受机械 剪切力作用而降解。
EDTA
是
Ca2+
和
Mg2+
等二价 金属离子的螯合剂,
在溶液
I
中加入
EDTA
,是要把大肠杆菌细胞 中的二价金属离子都螯合掉,从而
起到抑制
DNA
酶对
DNA
的降解 和抑制微生物生长的作用。
另外也可保证溶菌酶活
性。
②
Solution II
的作用:提供碱性条件,
pH
高达
12.6
,使大肠杆菌瞬间裂解,
促使染色体
DNA
和质粒
DNA
变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠(
SDS
)
可使细胞膜、核膜发生 破裂,充分溶解膜蛋白。同时,磺酸基与蛋白质形成复合
物而变形沉淀。
③
Solution III
的作用:为
KAc-HAc
缓冲液。该 溶液所含有的高浓度钾离子与
溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾,
从而 将与之结合的
绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组
DNA
一起沉淀,
与 质粒分离开来;
另
外溶液
III
所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性,使
pH
降至中性,因为长时间的
碱性条件会打断
DNA
;基因组
DN A
一旦发生断裂,只要是
50-100kb
大小的片段,
就没有办法再被PDS
共沉淀,这样就跟质粒
DNA
共存了。而且在整个质粒
DNA的提取过程中,
沉淀
DNA
时用无水乙醇及在高盐、
低温条件下进行都是 为了用化
学或物理手段将基因组
DNA
分子和蛋白质发生变性、
在体系中的溶 解度降低,
较
充分的分离提纯出实验所需的质粒
DNA
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本文更新与2021-02-02 18:10,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:http://www.xapfxb.com/yuer/442526.html
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