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治疗白癜风的药质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-02-02 18:10

男不育-包皮粘连

2021年2月2日发(作者:入地蜈蚣)
一、实验名称:质粒
DNA
的提取与纯化,
DNA
琼脂糖凝胶电泳< br>
二、实验原理:

1.
质粒
DNA
的提取:

质粒是一类存在于几乎所有细菌 等微生物中染色体之外
(细胞质中)
呈游离状态
的双链、闭环的
DNA
分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最
常用的基因克隆载体。除质粒外,大肠杆菌 中还含有基因组
DNA
、各种
RNA
、蛋
白质和脂质等物质,
因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体
DNA
等物质才能分
离纯化出质粒
DNA

分离制备质粒
DNA
的方法很多,
其中常用的方法有碱裂解 法、
煮沸法、
SDS
法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、
质粒分子大小、
碱基组成和结构等特点以及质粒
DNA
的用途进行选择。本实验使
用碱裂解法,
即利用
Solution



Ⅱ、
Ⅲ三种溶液分离提取质粒
DNA.
其原理如
下。


1
)碱裂解法提取大肠杆菌质粒
DNA
的原理:

碱裂解法提取质粒
DNA
是根据共价闭合环状质粒
DNA
和线性染色体DNA
之间变性
与复性的差异来分离质粒
DNA

达到分离提纯 质粒
DNA
的目的。

pH
值高达
12.6
的碱性 条件下,
线性的
DNA
因氢键断裂,
双螺旋结构解开而变性,
尽管在 这样的
条件下,
共价闭环质粒
DNA
的大部分氢键会被断裂,
但超螺 旋共价闭合环状的两
条互补链相互缠绕,不会完全分离。当加入
pH4.8
乙酸钾高盐 缓冲液恢复
pH

中性时,
共价闭合环状的质粒
DNA
复性 ,
恢复其天然构象,
以可溶状态存在于液
相中;
而线性的染色体
DN A
由于两条互补链彼此已完全分开、
分子量大、
结构复
杂而相互缠绕形成不溶 性网状结构。与不稳定的大分子
RNA
、变形的蛋白质以及
细菌碎片等一起沉淀而被除 去。
进一步用酚、
氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,
然后用无水乙醇沉淀,即可获得 纯化的质粒
DNA

Solution


、Ⅱ、Ⅲ三种溶
液以及无水乙醇沉淀
DNA
的具体作用和原理如下。


2
)四种溶液作用及原理:


Solution I< br>的作用:悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防

DNA
受机械 剪切力作用而降解。
EDTA

Ca2+

Mg2+
等二价 金属离子的螯合剂,
在溶液
I
中加入
EDTA
,是要把大肠杆菌细胞 中的二价金属离子都螯合掉,从而
起到抑制
DNA
酶对
DNA
的降解 和抑制微生物生长的作用。
另外也可保证溶菌酶活
性。


Solution II
的作用:提供碱性条件,
pH
高达
12.6
,使大肠杆菌瞬间裂解,
促使染色体
DNA
和质粒
DNA
变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠(
SDS

可使细胞膜、核膜发生 破裂,充分溶解膜蛋白。同时,磺酸基与蛋白质形成复合
物而变形沉淀。


Solution III
的作用:为
KAc-HAc
缓冲液。该 溶液所含有的高浓度钾离子与
溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾,
从而 将与之结合的
绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组
DNA
一起沉淀,
与 质粒分离开来;

外溶液
III
所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性,使
pH
降至中性,因为长时间的
碱性条件会打断
DNA
;基因组
DN A
一旦发生断裂,只要是
50-100kb
大小的片段,
就没有办法再被PDS
共沉淀,这样就跟质粒
DNA
共存了。而且在整个质粒
DNA的提取过程中,
沉淀
DNA
时用无水乙醇及在高盐、
低温条件下进行都是 为了用化
学或物理手段将基因组
DNA
分子和蛋白质发生变性、
在体系中的溶 解度降低,

充分的分离提纯出实验所需的质粒
DNA

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