试管婴儿着床视频过程免疫学实验-凝集试验

2021年2月2日发(作者：试管移植第二十三天头痛厌食)

免疫学实验
-
凝集试验


实验一

凝集试验


颗粒性抗原
(
细菌、螺旋体、红细胞等
)
与
相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗
原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝 集块，称为
凝集反应
(Agglutination reaction)
或凝集试验 。
参
与
凝
集
反
应
的
抗
原
称
为
凝
集
原
（
Agglutinogen
），抗
体
称
为
凝
集
素
（
Agglutin in
）
。

细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，
在悬液中相互排 斥而呈现均匀的分散状态。抗
原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形
成抗原抗体复合物， 降低了抗原分子间的静电
排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如
生理盐水）参与下，由于 离子的作用，中和了
抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去
了彼此间的静电排斥力，分子 间相互吸引，凝
集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集
反应。根据是否出现凝集反应及其 程度，对待
测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集
反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。


[
目的要求
]
1.
掌握平板凝集试验和试管凝集试验的
操作方法。

2.
掌
握
凝
集
试
验
的
结
果
判
定
及
判
定
标
准。

3.
熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所
需材料和试剂。

[
材料与试剂
]
1.
玻板，载玻片，试管（
1cm x 8cm
）
，
试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，
滴头（
ti p
头）
，牙签或火柴棒，记号笔。

2.
灭菌的生理盐水，灭菌的
0.5%
石炭酸
生理盐水。

3.
布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌
病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗
原， 布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血
清，被检血清（牛、羊或猪）
。

4.
鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血
清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。

[
实验内容及操作方法
]
（一）试管凝集试验

以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。


1.
试管准备：
每份血清用试管
4
支，
另取
3
支试管作为对照，作好标记，置试管架 上。如
被检血清有多份，对照只需做
1
份。

2.
被检血清稀释：第
1
管加入
2.3
ml

0.5%
石炭酸生理盐水，
第
2
、
3
、
4
管加入
0.5
ml

0.5%
石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸
取被检血清
0.2

ml

，加入第
1
管中，反复吹
吸
5
次混 匀，
吸取
1.5
ml

弃之，
再吸取
0.5
ml

加入第
2
管中，混匀后吸取
0.5

ml

加入第
3
管，
依此类推至第
4
管，
混匀后吸弃
0 .5
ml

（
见
表
1-1
）
。该被检血 清的稀释度分别是
1:12.5
、
1:25
、
1:50
、< br>1:100
。

3.
对照管制作：
第
5
管中加
0.5%
石炭酸生
理盐水
0.5
ml

，
第
6< br>管加
1:25
稀释的布氏杆
菌病阳性血清
0.5
ml

，
第
7
管加
1:25
稀释的
布氏杆 菌病阴性血清
0.5
ml

。

4.
加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原
用
0.5%
石炭酸生理盐水作
1:20
稀释，
每支试
管加
0.5
ml

。


表
1-1
布氏杆菌病试管凝集试验术式表
（单
位：
ml
）

试

管

号


1

2

3

4

5
6
对

照

管

7

最终血清稀释度


0.5%
石炭酸生理盐水

被检血清

抗原
(1
：
20)
1
：
25

2.3
0.2
0.5
1
：
50

0.5
0.5
0.5
1
：
100

0.5
0.5
0.5
1
：
200
抗

原


0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
阳性血清

1
：
25

0.5
0.5
阴性血清

1
：
25

0.5
0.5
弃
1.5
弃
0.5

5.
感作（反应）
：
7
支试 管加完抗原后，充
分混匀，置于
37
℃温箱中
4-10h
，取出后置 室
温
18-24h
（或
37
℃温箱
12-14h
， 取出后置室
温
2-4h
；或
37
℃温箱中
22-24 h
取出）
，然后
观察并记录结果。

6.
结果判定：判定 结果时用“
+
”表示反
应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原
被凝集的 程度及凝集块的形状，来判定凝集反
应的程度。

＋＋＋＋：
100
％抗原凝集，上清液完全
透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡
时，沉淀物呈片状、块状 或颗粒状。

＋＋＋：
75
％抗原凝集，
上清液略呈混浊，
菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如
上。
（管底凝集物与
100%
凝集 时相同，只是上
清液稍浑浊）
。

＋＋：
50
％抗原凝集，
上清液浑浊半透明，
管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）
。


＋：
25
％抗原凝集，上清液完全浑浊不透
明，管底有少量凝集物 或凝集的痕迹。

－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不
透明，但由于菌体的自然下 沉，在管底中央出
现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均
匀混浊。

7.
判定标准：能使
50%
抗原凝集的血清
最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）
。

牛 、马和骆驼的血清凝集价大于或等于
1:100
，判为阳性，
1:50
的凝集 价判为疑似反
应（可疑）
；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集
价大于或等于
1: 50
，判为阳性，
1:25
的凝集
价判为疑似反应（可疑）
。

[
注意事项
]
1.
实验时必须设抗原、阳性血清及阴性
血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。

2.
结果判为可疑时，隔
2-3
周后采血重
做。
阳性畜群 ，
重检时仍为可疑，
可判为阳性。
对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，
马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍
为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核
对 。


（二）布氏杆菌病平板凝集试验

1.
加血清：取 洁净玻板一块，用蜡笔划
成方格
（
4cm
2
）
，
并 注明被检血清号码，
以
100
?
L
微量可调加样器按下列量加被检血 清于方格
内，
第
l
格
80
?
L
、
第
2
格
40
?
L
、
第
3
格
20
?
L
、
第
4
格
10
?
L< br>。
血清用前需放室温，
使其温度达
20
℃左右。每一份检样需换一个< br>tip
头。

大规模检疫时，允许只用两个血清量作试
验，牛、马、骆 驼用
40
?
L
和
20
?
L
；猪、山< br>羊、绵羊、狗用
80
?
L
和
40
?
L
。

2.
加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集
抗原
30
?
L
，滴在血清附近，而不与血清接触。
从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原
混匀，一份血清用一根牙签。

抗原用前摇匀，
并置室温使其温度达
20
℃
左右。

3.
作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱
中或采用别的办法适当加温，
使温 度达到
30
℃
左右，
3-5min
内记录反应结果。

4.
对照：每次试验须用标准阳性血清和
阴性血清以及生理盐水作对照。

5.
结果判定：按下列标准记录反应结果。


＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透
明，即
100%
凝集。

＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透
明，即
75%
凝集。

＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即
50%
凝集。

＋：
液体混浊，
有小的颗粒状物，
即
25%
凝
集。

－：液体均匀混浊，无凝集现象。

6.
平板凝集试验与试管凝集试验的关系见
表
1-2
。

表
1-2
平板凝集试验与
试管凝集试验的关系

平

板

凝

集

相当于试管凝集

80
?
L
1:25
40
?
L
1:50
20
?
L
1:100
10
?
L
1:200

7.
判定标准：同试管凝集试验。

8.
注意：对于阳性及可疑的被检血清需用
试管凝集试验进行验证。

（三）虎红平板凝集试验

这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布
氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试