省立医院生殖医学中心PCR技术在临床检验中的应用

2021年2月1日发(作者：肝病医院)
PCR
技术在临床检验中的应用



生物技术支持




医学检验大致可分为形态学、生 物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。
60
年代
D NA
双螺旋结构及半保留复制模式的出现，
70
年代基因重组及体外基因克隆技术、< br>分子杂交技术的应用使分子生物学在疾
病诊断中得到了长足的发展。特别是
1985年
Mullis
发明了聚合酶链式反应（
PCR
）技术，使医学界真正兴 起了基因诊断
技术热，
成为现代医学发展的又一里程碑。
用于临床检验的
PC R
技术与经典的
PCR
反应在操作上稍有区别，
有其自己的特
色。一 般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对
DNA
纯化有限，但适应临床 微量、快速的特点。
另外
PCR
反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，
具有极高
的使用价值。
本公司 率先研制并推出单管单人份的
PCR
诊断试剂，
具有开创性意义。
这些改进都 不影响
PCR
效果，
同样表
现出高特异性、高敏感性、简便快捷等
P CR
最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、
法医学等广泛 领域中有相当高的实际应用价值。



常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣 原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。
消化系统感染性疾病在我 国具有代表性意义的有肝炎、
胃炎及肠道感染性疾病。
引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒
（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎 病毒（戊肝）、
庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是
DNA
病毒，其余均为
RNA
病毒。我国是乙肝高发区，乙
肝病人为世界乙肝病人总数的< br>50
％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外
周血白细胞中。
通常用
PCR
法检测血清中的乙肝病毒。
有报道用
PCR
法可以在泪液、乳汁、
精液及血白细胞中检出乙肝病
毒，这些发现提示其它传染 途经存在的可能。
PCR
法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为
PCR
扩增极其敏感，理论
上可检出
100CID/ml
乙肝病毒的患者血清，
在感 染潜伏期即可被
PCR
法检出。
②对低持续感染乙肝病人的诊断，
有些乙肝< br>病人体内的病毒长期低复制感染，
血清病毒浓度极低，
一般酶标试剂无法检出，
可以用
PCR
法检出。③疗效跟踪及病程判
断，
因为
PCR
能半定量检测乙肝病毒基因，
是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。
在治疗过程中通过监 测血清或白
细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。
丙型肝炎病毒在血清中 的浓度很低，
丙肝病毒的分离尚未成
功。
目前用于丙肝病毒检验的方法主要是
ELISA
法测定血清中的
HCV
抗体。
由于
HCV
尚无法 分离纯化，
所以用于包被的抗
原是人工合成肽或基因工程蛋白，
这些人工抗原与天然病 毒抗原有一定的区别，
理论上是存在假阳性或假阴性。
同时血清
中抗体的出现及动态变 化与病人病情无线性相关关系。
RT
－
PCR
技术使这些困难得到解决。HCV
是
RNA
病毒，需先将病毒
RNA
逆转录为
cD NA
（
RT
）后再进行
PCR
扩增，这种技术称之为逆转录－
PCR
（
RT
－
PCR
）。
PCR
敏感性高可以 检测出血清中
低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。
RNA
纯化要求严格， 是
RT
－
PCR
的技术关键，本公司目前使用的高效基
因释放剂，< br>联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，
对样本中的
RNA
进行分离纯化，
使这一问题得到解决。
通常用于
RNA→cDNA
逆转录的酶大致可以分为二大类，即 低温逆转录酶，如
AMV/MLV
逆转录酶，高温逆转录酶，如
Tth
酶。< br>Tth
酶在锰离子作
用下，具有逆转录酶活性，
Tth
酶活性温度高， 可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。
Tth
酶在镁离子的作
用下，又具有
DNA
聚合酶活性，
从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，
这 样就在不降低扩增敏感性的条件下，
一步完
成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测 的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的
RT
－
PCR
诊 断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人
粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在
PCR
检测时，需注意取材的合理 性。在消化道传染性疾病中，另一类
最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（
HP
）所引 起的胃炎、胃溃疡等。
HP
可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细
胞，早期表现 为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对
HP
的检测 应受到广大
医务工作者的重视。
对
HP
的检测可以用生化法测试尿素酶或用免 疫法测试血清中对
HP
特异性抗体，
也可对胃液、
胃粘膜
样本进行细 菌培养及菌种鉴定。
PCR
法检测
HP
非常敏感且特异性高，有研究发现可以 从病人的唾液或口腔含漱液中检出
HP
。
PCR
法避免了取胃液及胃粘膜，减 少病人痛苦，是目前最理想的方法。



呼吸系统感染性疾病主要的有肺结 核、
非典型性肺炎等。
结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，
一度是较严重的致死性疾病之一。
解放以后由于对结核病的预防的重视，
特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结
核病有抬头的趋势，
基原因可能有两方面，
其一 是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。
结核菌痰涂片镜检阳
性率太低，
酶 标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，
结核检测的金标准是结核菌培养法。
但培养法费时昂贵并 且受到用药
的影响，在实际应用中受到限制。
PCR
在结核菌检测方面有简便、敏感、 特异的优点。一般认为样本中内要有
100
个左右
的结核菌即可被检出。
目前 用于结核菌
PCR
诊断的试剂，
其引物主要来源于以下基因片段
36KD/6 5KD
抗原蛋白基因；
染色
体重复插入序列
IS986
、
I S960
、
IS6110
、染色体质粒
DNA
PH7311
、
PMTB4
、
P36
基因等。其中最常用的是染色体重复插入
序 列
IS986
或
IS6110
，
1990
年
Her mans
首先介绍并使用了
IS986
基因设计的引物扩增产物为
245BP
，研究表明这一基因
对人型结核菌有特异性。而后
Thierry
又介绍了插 入序列
IS6110
基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比
IS986
更 高
的特异性及敏感性，最适合

的检测。结核菌痰标本的
PCR
检测应 注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增
产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以 外有两条产物带，
这与插入序列本身各片段长度有差异、
结核菌在
治疗过程中染色体畸 变、
断裂、
缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，
凡在阳性对照相 应位置有明显
条带的判阳性，
否则应为阴性，
或建议病人过一些时间后再复检一次；< br>其二，
结核痰样本
PCR
检测时，
要使样本充分液化，
否则痰 液中的粘液成份将影响扩增效果，
甚至会导致严重非特异性扩增，
电泳结果呈雾状；
基 三，结核痰样本
PCR
检测结
果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规 律排菌有关。



循环系统以肠道小
RNA
病毒感染最具 代表意义，
如柯萨奇病毒等。
这些病毒经肠道粘膜、
淋巴结进入血液，最终可定
位于心肌细胞中导致心肌炎。
目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。
PCR
用于柯萨奇病毒检测时因其是
RNA
病毒
所以应注意样本的保存。
外在环境中 存在大量
RNA
酶，
病毒脱壳后
RNA
将被迅速降解。
一般 用于
RNA
检测的血清常温下不
应超过
24
小时，4℃下可保存2
天，
-
20℃下可以保存
2
月以下。



PCR
检测在性传播性疾病
(STD)
的诊断中有较广泛的应用。 经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软
锐湿疠、硬下疳等。而在现代
STD< br>中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（
NGU
）可能更具有代表性意义。
梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，
首先在局部形成硬软下疳，
布后经血行播散到全身，< br>最严重的是波及中枢神经系统。
感染
早期，
梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，< br>可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，
用洁
净棉签取 渗出液样本作
PCR
检测，
其敏感性及特异性极高。
二期梅毒皮疹中也存在梅 毒螺体其取样方法同埂下疳，
三期梅
毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此
III
病人及部分无皮疹的
I
、
II
期梅毒病人可以取
EDTA
抗 凝全血检测。淋病是目前发
病率最高的性传播性疾病之一，
由淋病双球菌引起。
淋病双 球菌一般为胞内寄生，
常见的感染部位为外生殖器、
尿道粘膜
最常见。
在尿道 及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，
对分泌物拭子进行涂片镜检时，
常导致误诊。另 外目前非
淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响 。
PCR
法简便、快捷、准
确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质 粒
DNA
或
16s RNA
基因。
16s RNA
基因设计 的引物特异性高但
其敏感性低；
隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，< br>判断结果时应以阳性对照为标准，
凡在阳性对
照相应部位有明显条带的为阳性，
其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，
费时且昂贵，
简
便快速的
PCR
检测对其有极高的使用价值。
沙眼衣原体、
解脲支原体样本来 源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，
由于分泌物
中有许多污物含有
PCR
扩增的 抑制剂，
因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，
如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。
PCR
也可以用检测单纯疱疹
病毒、
EB
病毒、
乳头瘤病毒等。
引 物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤
（
HPV
）
,
可致生殖系统感染的乳 头瘤病毒主要是
6
、
11
、
16
、
18
、
33
型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不 密切，经常有交
叉或多型民时感染。
为简化操作，
对其基因对比分析寻找共同序列设计 的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化
操作又减少费用是一种极理想的方法。



我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高 ，占恶性肿瘤死亡总数的
60
％以
上。
引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境 因素及遗传背景。
外界因此可分为三大类即化学、
物理及生物因素。肿瘤与遗
传有关的 证据越来越多，
除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、
肾母细胞瘤等以外，
还在几 乎所有的肿瘤细胞中观察
到原癌基因的重排，
这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿 瘤。
癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导
细胞恶性转化的基因，
它们是在研究 逆转录病毒时发现的。
目前已知的肿瘤基因有
60
多种，
1969
年
Hubner
根据
Rous(1911)
的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种 能诱导宿主细胞转化的
RNA
病毒性癌基因（
Viral
Oncogene
）。后来又在其它哺乳动
物基因中发现与病毒癌基因同源序列，
这种正常的细胞基因表 达产物与细胞生长、
增殖、
分化有关。
但若被某种因素激活
就会转化为有活力 的癌基因，通常称之为原癌基因（
Proto
Oncogene
）。为了与病毒癌基 因区分，分别用
V-Onc
及
C-Onc
基因来代表。目前了解较多的癌基因 （
C-one
）有
scr
基因族、
ras
基因族、
mgc
及
myb
基因族。原癌基因存在于正常细
胞中，
并表达生物功 能，
只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，
可能的原癌基因活化机理有：
①点突 变，
受到射线、