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在用
SDS-
凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：
1
．如果蛋白质
-SDS
复合物不能达到
1.4
克
SD S/1
克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能
得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS
结合的因素主要有以下
3
个：
（
1
）
二 硫键是否完全被还原：
只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，
SDS
才能 定量地结合到蛋白质分子上去，
并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需 进一步将形成的巯基
烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。
（
2< br>）溶液中
SDS
的浓度：溶液中的
SDS
的总量，
至少要比蛋 白质的量高
3
倍，
一般需高达
10
倍以上。
（
3< br>）
溶液的离子强度：
溶液
的离子强度应较低，最高不能超过
0.26< br>，因为
SDS
在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存
在的，
SDS
结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时
SDS
单体的浓度而不是总浓度，在低离< br>子强度的溶液中，
SDS
单体具有较高的平衡浓度。
2< br>．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，
Weber
的实验指出，在
5%< br>的凝胶中，分子量
25,000
—
200,000
的
蛋白质
，其
分子
量
的对
数
与迁
移率
呈直线
关系
；
在
10%
的
凝
胶中
，10.000
—
70,000
分子量的蛋白质呈直线关系；
在
1 5%
的凝胶中，
10,000
—
50,000
分子量的蛋白质
呈直线关系；
3.33%
（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是
2.6%
） 的凝胶可用于分子量更高的
蛋白质。
可根据所测分子量范围选择最适凝胶 浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋
白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（ 蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为
相对迁移率，详见后）最好在
0.2
—< br>0.8
之间均匀分布。
在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而 在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制
得完全一致，因此，用
SDS-
凝胶 电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不
得利用另一次电泳的标准曲线。
3
．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如
α
-
胰凝乳蛋白酶）组成的，它
们在
SDS
和巯基乙醇的作用下，解离成亚基 或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，
SDS-
凝胶
电泳测定的只是它们的亚基或单 条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面
的资料，
还必须用其它方法测定其 分子量及分子中肽链的数目等，
与
SDS-
凝胶电泳的结果互相
参照。
2
．试剂：
（
1
）标准蛋白质
目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于
SDS- PAGE
测定未
知蛋白质分子量。
②低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院 上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表
16-2
）
。
表
16-2 5
种标准蛋白质
蛋白质名称
Mr
磷酸化酶
B
牛血清蛋白
肌动蛋白
磷酸酐酶
烟草花叶病毒外壳蛋白
94 000
67 000
43 000
30 000
17 500
每种蛋白含量为
40μg
。用时加入
200μl
样品溶解，经处理后，上样
10μl
（
2μg
） 就能显示出清
晰的条带。
③自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合 试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常
用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择
3
—
5
种蛋白质，如马心细胞色素
C
（
Mr12
500
）
、牛
胰胰凝乳蛋白原
A
（
Mr25 000
）
、猪胃胃蛋白酶（
Mr35 000
）
、鸡卵卵清蛋白（
Mr43 000
）
、牛血
清白蛋白（
Mr67
000
）等蛋白质， 按照每种蛋白
0.5
—1mg?ml
-1
样品溶解液配制。可配制成单
一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
（
2
）不连续体系
SDS-PAGE
有关试剂
①
10%
（
W/V
）
SDS
溶液：称
5g SDS
，加重蒸水至
50ml
，微热使其溶解，置试剂瓶中，
4
℃贮
存。
SDS
在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
②
1%TEMED
（
V/V
）
：取
1mLTEMED< br>，加重蒸水至
100ml
，置棕色瓶中，
4
℃贮存。
③
10%AP
（
W/V
）
：称
AP1g
，加重蒸水至
10ml
。最好临用前配制。
④样品溶解 液：内含
1%SDS
，
1%
巯基乙醇，
40%
蔗糖或
20%
甘油，
0.02%
溴酚蓝，
0.01mol?L
-1
pH8.0 Tris-HCl
缓冲液。
●
先配制
0.05mol?L
-1
pH8.0
Tris-HCl
缓冲液：称
Tris
0.6g
，加入
50ml
重蒸水，再中入约
3ml
1mol?L
-1 HCl
，调
pH
至
8.0
，最 后用重蒸水定容至
100ml
。
●
按表
16-4
配制样品溶解液。
表
16-4
不连续体系样品溶解液配制
SDS
巯基乙醇
溴酚蓝
蔗糖
0.05mol?L
-1Tris-HCl
加重蒸水至最
后总体积为
100mg
0.1ml
2mg
4g
2ml
10ml
*
如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。
⑤凝胶贮液
●
30%
分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称
Acr
30g
及
Bis
0.8g
，溶于重蒸水中，最后定
容至< br>100ml
，过滤后置棕色试剂瓶中，
4
℃贮存。
●
10%
浓缩胶贮液：称
Acr
10g
及
Bis
0.5g
，溶于重蒸水中，最后定容至
100mL
，过滤后置棕色
试 剂瓶中，
4
℃贮存。
⑥凝胶缓冲液
●
分离胶缓冲液（
3.0mol?L
-1 pH8.9 Tris- HCl
缓冲液）
：称
Tris 36.3g
，加少许重蒸水使其溶解，
再加
1mol?L
-1 HCl
约
48ml
，调
pH
至
8.9
，最后加重蒸水定容至100ml
，
4
℃贮存。
●
浓缩胶缓冲液（
0.5mol?L
-1 pH6.7 Tris-HCl< br>缓冲液）
：称
Tris6.0g
，加少许重蒸水使其溶解，再
加
1mol?L
-1 HCl
约
48ml
调
pH
至
6.7
。最后用重蒸水定容至
100ml
，
4
℃贮存。
⑦电极缓冲液
（内含
0.1%SDS
，
0.05mol? L
-1 Tris
—0.384 mol?L
-1
甘氨酸缓冲液
pH 8.3
）
：
称
Tris6.0
，
甘氨酸
28.8g
，加入
SDS 1g
，加蒸馏水使其溶解后定容至
1000ml
。
⑧< br>1%
琼脂
（糖）
溶液：
称琼脂（糖）
1g
，
加电极缓冲液
100ml
，
加热使其溶解，
4
℃贮存，
备用 。
（
4
）固定液
取
50%
甲醇
454ml
，冰乙酸
46ml
混匀。
（
5
）染色液
称考马斯亮蓝
R250 0.125g
，加上述固定液
250ml
，过滤后应用。
（
6
）脱色液
冰乙酸
75ml
，甲醇
5 0ml
，加蒸馏水定容至
1000ml
。
四、操作步骤：
（一）安装夹心式垂直板电泳槽
关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如 图
16-4
。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成
的电极槽，
两个电极槽中间夹有 一个凝胶模，
该模由
1
个
形硅胶框、
长与短玻璃板及样 品槽模
板
（梳子）
所组成
（见图
16-5
）
。电泳槽由上贮槽
（白金电极在上或面对短玻璃板）
，
下贮槽
（白
金电极在下或面对长玻璃板）
和回纹状冷凝管组成。
两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。
各部间依下列顺序组装：
2
、将长、短玻璃板分别插到
形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3
、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
4
、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
5
、
竖直电泳槽，
在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已 融化的
1%
琼脂
（糖）
。
其目的
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